मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण और ठहराव के Intratumoral पीडी-1+ टिम-3+ सीडी+ टी कोशिकाओं
Summary
ट्यूमर microenvironment का अध्ययन शकुन या immunotherapy करने के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया के पूर्वानुमानित मार्क्स की पहचान कर सकते हैं । यहां प्रस्तुत है, एक अभिनव सीटू प्रतिदीप्ति multispectral इमेजिंग में पर आधारित पद्धति का विश्लेषण और सीडी+ टी कोशिकाओं के स्वचालित रूप से विभिंन उपआबादी गिनती है । यह प्रतिलिपि और विश्वसनीय तकनीक बड़े पलटन विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
प्रतिरक्षा कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के महत्वपूर्ण घटक है और कैंसरजनन के सभी चरणों में ट्यूमर के विकास और विकास को प्रभावित करते हैं । विशेष रूप से, यह अब अच्छी तरह से स्थापित है कि प्रतिरक्षा मानव ट्यूमर में घुसपैठ निदान और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी कर सकते हैं । ट्यूमर microenvironment में प्रतिरक्षा घुसपैठ का विश्लेषण रोगियों के वर्गीकरण और उपचार के लिए प्रतिक्रिया के लिए एक बड़ी चुनौती बन गया है ।
इस तरह के कार्यक्रम सेल मौत प्रोटीन 1 के रूप में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की सह-अभिव्यक्ति (PD1; भी CD279 के रूप में जाना जाता है), साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट जुड़े प्रोटीन 4 (CTLA-4), टी सेल Immunoglobulin और प्रोटीन युक्त Mucin-3 (टिम-3; भी CD366 के रूप में जाना जाता है), और लिम्फोसाइट सक्रियण 3 जीन (अंतराल-3; भी CD223 के रूप में जाना), टी सेल थकावट की एक बानगी है । हम सीटू में एक multiparametric विकसित इम्यूनोफ्लोरेसेंस की पहचान करने और सेलुलर स्तर पर इन निरोधात्मक रिसेप्टर्स के सह अभिव्यक्ति की मात्रा को बढ़ाता है. गुर्दे सेल कार्सिनोमा (आरसीसी) के जमे हुए ऊतक के एक पूर्वव्यापी श्रृंखला पर, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित एक प्रतिदीप्ति multispectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि सीडी के सह-अभिव्यक्ति पीडी-1 और टिम-3 में घुसपैठ के ट्यूमर पर+ टी कोशिकाओं आरसीसी में एक गरीब रोग का निदान के साथ संबंधित है । हमारे ज्ञान के लिए, यह पहले अध्ययन का प्रतिनिधित्व करता है कि सीटू प्रौद्योगिकी में इस स्वचालित मल्टीप्लेक्स कुछ नैदानिक प्रासंगिकता हो सकता है ।
Introduction
पिछले कुछ वर्षों में, immunotherapy आरसीसी सहित कई प्रकार के कैंसर के लिए बहुत आशाजनक उपचार के रूप में उभरा है । विशेष रूप से, पीडी-1 और CTLA-4 जैसे निरोधात्मक चौकियों के अवरोधों पर आधारित immunotherapy को चिकित्सीय रूप से प्रभावी1,2,3,4,5, 6. CTLA के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-4, पीडी-1, या कार्यक्रम मौत Ligand 1 (पीडी-L1) पहले से ही कई कैंसर में अनुमोदित कर रहे हैं और रोगियों के 20% से अधिक में लंबे समय तक चलने नैदानिक प्रतिक्रियाओं के लिए नेतृत्व7. फिर भी, नहीं सभी रोगियों के जवाब हैं, उपचार की लागत अधिक है, और इन उपचार विषाक्त कर रहे हैं, संभावित गंभीर स्व-प्रतिरक्षित साइड इफेक्ट की तरह करने के लिए अग्रणी. इसलिए, मौजूदा चुनौती के लिए उन नए immunotherapies के लिए पूर्वानुमान मार्करों की पहचान है । ट्यूमर में उत्परिवर्तन की दर, पीडी-L1 की अभिव्यक्ति, या intratumoral सीडी+ टी सेल घुसपैठ के स्तर को नैदानिक प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी करने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि, इस संघ अभी भी नैदानिक अभ्यास में इन नैदानिक के प्रयोग की सिफारिश कमजोर है पीडी-L1 के लिए साथी के लिए परीक्षण के अलावा गैर में Pembrolizumab के प्रशासन से पहले छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगियों8 ,9,1011,12. यह प्रदर्शन किया गया है कि पीडी-1, टिम-3, लैग-3, और CTLA-4 जैसे कई निरोधात्मक रिसेप्टर्स की सह-अभिव्यक्ति, एक सेल थकावट phenotype और प्रतिरोध के लिए प्रेरित करता है13,14,15. चूंकि परिधीय रक्त ट्यूमर microenvironment का प्रतिनिधि नहीं है, यह उच्च ब्याज की है सीटू मेंकोशिकाओं की phenotypic सुविधाओं का विश्लेषण. पीडी-1 और टिम-3 सह एक्सप्रेस टी कोशिकाओं कई संदर्भों में कार्यात्मक बिगड़ा कोशिकाओं को13,16,17जाना जाता है । इस अध्ययन में दो निरोधात्मक रिसेप्टर्स पीडी-1 और टिम-3 पर सीडी+ टी कोशिकाओं की सह-अभिव्यक्ति के शकुन प्रभाव का आकलन किया गया ।
अब तक, सह का अध्ययन ट्यूमर घुसपैठ पर कई मार्करों की अभिव्यक्ति लिम्फोसाइटों (TILs) मुख्य रूप से प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा किया गया है, यह ताजा ट्यूमर पर काम करने के लिए आवश्यक बनाने और इसलिए precluding पूर्वव्यापी विश्लेषण. सीटू धुंधलाing में पारंपरिक के साथ, एक समय में केवल एक धुंधला प्रदर्शन किया जा सकता है, और सेल प्रकार है कि सह मार्करों व्यक्त की विशेषताओं संभव नहीं है । उदाहरण के लिए, पीडी-L1 ट्यूमर microenvironment के कई कोशिका प्रकार द्वारा व्यक्त किया जाता है, यह मुश्किल पारंपरिक immunohistochemistry विश्लेषण द्वारा परिभाषित करने के लिए जो पीडी-L1 एक्सप्रेस कोशिकाओं correlative अध्ययन के लिए और अधिक प्रासंगिक हैं कर रहे हैं. इस कार्य में, हमने आरसीसी में नैदानिक परिणामों के साथ सीडी+ टी-कोशिकाओं को ट्यूमर के द्वारा पीडी-1 और टिम-3 की सह-अभिव्यक्ति को सहसंबंधित करने के लिए कंप्यूटर-काउंटिंग के साथ सीटू multiparametric इम्यूनोफ्लोरेसेंस पद्धति में एक अभिनव विकसित किया । इस तकनीक को एक ही कक्ष स्तर पर विश्लेषण और एक ही समय में एकाधिक मार्करों एक multispectral कैमरा है कि प्रतिबंधित अंतराल पर कब्जा कर सकते हैं का उपयोग करने की संभावना सहित कई फायदे हैं > 10 एनएम लिक्विड क्रिस्टल फिल्टर के माध्यम से18. इसके अलावा, प्रक्रिया स्वचालित है जो एक अंतर ऑपरेटर reproducibility और एक छोटा विश्लेषण मैनुअल तकनीक19की तुलना में सक्षम बनाता है । कैंसर के क्षेत्र में, कई अध्ययनों पीडी-1, पीडी-L1, और मार्केल में सीडी-सेल कार्सिनोमा, फेफड़ों के कैंसर, और सिर और गर्दन कैंसर20,21,22की तरह प्रतिरक्षा अणुओं के कई दाग कायल की सूचना दी, 23. स्वचालित सेल गणना उपयोगकर्ता (phenotyping कदम) द्वारा प्रशिक्षण के साथ संभव है । प्रतिदीप्ति अलग सेल डिब्बों (नाभिक, कोशिका, और झिल्ली) में मापा जाता है ।
यहाँ, ट्यूमर के विभिन्न सबसेट-घुसपैठ सीडी+ टी कोशिकाओं आरसीसी के एक बड़े पलटन में पीडी-1 और/या टिम-3 व्यक्त की गणना की गई और परिणाम नैदानिक गुरुत्वाकर्षण स्कोर और अस्तित्व के मापदंडों के साथ संबंधित थे. यह भी cytometry में की तरह प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) डेटा मतलब के साथ सेलुलर संकल्प पर झिल्ली प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए संभव था. जहां तक हम जानते हैं, यह इस multispectral इमेजिंग आधारित गणना तकनीक का उपयोग कर शकुन परिणाम रिपोर्टिंग पहले अध्ययन का प्रतिनिधित्व करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
संशोधन और समस्या निवारण:
ऊतक की गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है; इसे आसानी से hematoxylin और eosin रंगाई से चेक किया जा सकता है ।
इस तकनीक का एक लाभ मल्टीप्लेक्स दाग की संभावना है, लेक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Institut नेशनल ड्यूल कैंसर (इंका) (ईटी), Ligue contre le cancer (ईटी), विश्विद्यालय सोरबोन पेरिस cite (एट), ANR (Selectimmunco) (एट), Labex bliss-ऑन्कोलॉजी (एट), सिर्क CARPEM (सीजी, एट) से अनुदान द्वारा समर्थित था । EdG स्नेहन चाप की एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । EV और सीडी APHP (बाजार année सूक्ष्म) के एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । ChB विश्विद्यालय सोरबोन पेरिस cite (contrat डॉक्टरेट) के एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है । लेखक इस परियोजना में अपनी फंडिंग के लिए ब्रिस्टल मायर्स Squibb का शुक्रिया अदा करते हैं । लेखकों ने डिपार्टमेंट ऑफ पैथोलॉजी ऑफ Hopital Européen जार्ज्स Pompidou और नैक (Laurianne Chambolle, Elodie मिशेल और Gisèle Legall) का शुक्रिया अदा किया । लेखकों ने PARCC के प्रोटोकॉल मंच, Hopital Européen जार्ज्स Pompidou (Corinne Lesaffre) का धन्यवाद किया ।
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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