Multiplexed immunofluorescenza analisi e quantificazione di Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T cellule
Summary
Studiando il microambiente tumorale può identificare biomarcatori prognostici o predittivi della risposta clinica all’immunoterapia. Presentato qui, è un metodo innovativo basato su in situ di fluorescenza multispectral imaging per analizzare e contare automaticamente varie sottopopolazioni di CD8+ T cellule. Questa tecnica riproducibile ed affidabile è adatta per analisi di grande gruppo.
Abstract
Le cellule immunitarie sono componenti importanti del microambiente tumorale e influenzano la crescita del tumore e l’evoluzione in tutte le fasi di carcinogenesi. In particolare, è ora ben stabilito che il sistema immunitario si infiltrano in tumori umani possono correlare con prognosi e risposta alla terapia. L’analisi del sistema immunitario infiltrarsi nel microambiente tumorale è diventata una sfida importante per la classificazione dei pazienti e la risposta al trattamento.
La co-espressione di recettori inibitori quali programma delle cellule morte Protein 1 (PD1; anche conosciuto come CD279), citotossica dei linfociti T Associated Protein 4 (CTLA-4), T-cellula immunoglobulina e mucina contenente proteine-3 (Tim-3; anche conosciuto come CD366) e dei linfociti Attivazione genica 3 (Gal-3; anche conosciuto come CD223), è un segno distintivo dell’esaurimento delle cellule T. Abbiamo sviluppato una multiparametrica in situ l’immunofluorescenza che macchia per identificare e quantificare a livello cellulare il co-espressione di questi recettori inibitori. Su una serie retrospettiva di tessuto congelato dei carcinoma delle cellule renali (RCC), utilizzando una tecnologia di imaging multispettrale fluorescenza accoppiato con un software di analisi di immagine, è stato trovato che il co-espressione del PD-1 e Tim-3 il tumore infiltrante CD8+ T cellule è correlata con una prognosi difficile in RCC. A nostra conoscenza, questo rappresenta il primo studio che dimostra che questo automatizzato tecnologia multiplex in situ può avere qualche rilevanza clinica.
Introduction
Negli ultimi anni, l’immunoterapia è emerso come un trattamento molto promettente per molti tipi di cancri, compreso il controllo delle chiamate remote. In particolare, l’immunoterapia basata sull’inibizione di punti di controllo inibitori come PD-1 e CTLA-4 è stato segnalato per essere clinicamente efficace1,2,3,4,5, 6. anticorpi monoclonali contro CTLA-4, PD-1, o programma morte Ligand 1 (PD-L1) sono già approvati in parecchi cancri e portare a lunga durata le risposte cliniche in oltre il 20% dei pazienti7. Tuttavia, non tutti i pazienti sono di intervento, il costo del trattamento è elevato, e questi trattamenti sono tossici, che conduce a potenziali gravi effetti collaterali autoimmune-come. Pertanto, la sfida attuale consiste nell’identificare marcatori predittivi per quelle nuove immunoterapie. Il tasso di mutazioni nel tumore, l’espressione del PD-L1 o i livelli di intratumoral CD8+ infiltrazione delle cellule di T sono stati segnalati per correlare con la risposta clinica. Tuttavia, questa associazione è ancora troppo debole per raccomandare l’uso di questi biomarcatori clinici nella pratica clinica, ad eccezione del test di compagno per PD-L1 prima dell’amministrazione di Pembrolizumab non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC) pazienti8 ,9,1011,12. È stato dimostrato che la co-espressione di molti recettori inibitori come PD-1, Tim-3, Gal-3, e CTLA-4, induce un fenotipo delle cellule di esaurimento e la resistenza alla terapia13,14,15. Poiché il sangue periferico non è rappresentativo del microambiente tumorale, è di grande interesse per analizzare le caratteristiche fenotipiche delle cellule in situ. Cellule di T di co-espressione PD-1 e Tim-3 sono noti per essere cellule funzionalmente alterate in diversi contesti13,16,17. In questo studio, l’impatto prognostico della co-espressione di recettori inibitori due PD-1 e Tim-3 il CD8+ T cellule è stata valutata.
Fino a ora, studiando il co-espressione di marcatori multipli su tumore infiltrante linfociti (TILs) è stata effettuata principalmente dall’analisi di citometria a flusso, rendendo necessario per lavorare su tumori freschi e pertanto senso che osta alla analisi retrospettive. Con la colorazione convenzionale in situ può essere eseguita solo una colorazione in un momento e la caratterizzazione del tipo cellulare che co-esprime i marcatori non è possibile. Ad esempio, PD-L1 è espressa da molti tipi di cellule del microambiente tumorale, che lo rende difficile da definire mediante analisi immunohistochemistry convenzionali quali le cellule che esprimono PD-L1 sono più rilevanti per gli studi correlativi. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un metodo innovativo in situ multiparametrica immunofluorescenza con computer-contando per correlare il co-espressione di PD-1 e Tim-3 da tumore infiltrante CD8 T-cellule+ con i risultati clinici in RCC. Questa tecnica ha diversi vantaggi, tra cui la possibilità di analizzare a livello di singola cellula e marcatori multipli allo stesso tempo utilizzando una macchina fotografica multispettrale che può catturare intervalli limitati > 10 nm attraverso cristalli liquidi filtri18. Inoltre, la procedura è automatica e consente una riproducibilità inter-operatore e un’analisi ridotta rispetto alle tecniche manuali19. Nel campo del cancro, parecchi studi riferito convincente stainings multiple di molecole immuni come PD-1, PD-L1 e CD8 nel carcinoma delle cellule di Merkel, cancro ai polmoni e testa e collo cancro20,21,22, 23. il conteggio delle cellule automatizzato è possibile con la formazione da parte dell’utente (passaggio phenotyping). La fluorescenza è misurata nei compartimenti cellulari differenti (nuclei, citoplasma e membrana).
Qui, diversi sottoinsiemi di tumore-infiltrazione CD8+ T cellule esprimenti PD-1 e/o Tim-3 in un’ampia coorte di RCC sono stati contati e i risultati sono stati correlati con punteggi di gravità clinica e parametri di sopravvivenza. È stato anche possibile analizzare l’intensità di fluorescenza della membrana alla risoluzione del cellulare con i dati di intensità di fluorescenza media (MFI) come in citometria. Per quanto ne sappiamo, questo rappresenta i primi risultati prognostici Report Studio utilizzando questa tecnica di conteggio base imaging multispettrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
La qualità del tessuto è un parametro importante; può essere facilmente controllato tramite colorazione ematossilina ed eosina.
Uno dei vantaggi della tecnica è la possibilità di stainings multiplex, ma per evitare fluoroforo spillover, consiglia di scegliere lunghezze d’onda di emissione con delta di minimo 10 nm. Qui, perché abbiamo avuto 4 stainings compreso DAPI, abbiamo scelto stendere le lunghe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Labex Immuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET), Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Parigi Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET). EdG è stato finanziato da una borsa di studio della Fondation ARC. EV e CD sono stati finanziati da un sodalizio di APHP (bourse année recherche). ChB è finanziato da una borsa di studio dell’Université Sorbonne Parigi Cité (contrat doctoral). Gli autori ringraziano la Bristol Myers Squibb per il loro finanziamento in questo progetto. Gli autori ringraziano il reparto di patologia dell’Hôpital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Gli autori ringraziano la piattaforma di istologia del PARCC, Hôpital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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