Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen
Summary
Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.
Abstract
Immunzellen sind wichtige Bestandteile der Tumor Mikroumgebung und Tumor-Wachstum und Entwicklung in allen Phasen der Krebsentstehung beeinflussen. Bemerkenswert ist, ist es inzwischen gut etabliert, dass das Immunsystem Infiltrat in menschlichen Tumoren mit der Prognose und ansprechen auf die Therapie korrelieren kann. Die Analyse der immun zu infiltrieren in der Mikroumgebung Tumor ist eine große Herausforderung für die Klassifizierung von Patienten und das Ansprechen auf die Behandlung geworden.
Der Co Ausdruck der inhibitorischen Rezeptoren wie Programm Cell Death Protein 1 (PD1; auch bekannt als CD279), zytotoxischen T-Lymphozyten Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Zell-Immunglobulin und Mucin enthält Protein-3 (Tim-3; auch bekannt als CD366) und Lymphozyten Aktivierung-Gen 3 (Lag-3; auch bekannt als CD223), ist ein Markenzeichen der T-Zell-Erschöpfung. Wir entwickelten ein multiparametric in Situ Immunfluoreszenz beflecken, zum identifizieren und quantifizieren des Co Ausdrucks dieser hemmenden Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Auf einer retrospektiven Reihe von tiefgefrorenem Gewebe renal Cell Karzinome (RCC), mit einem multispektrale Fluoreszenz-imaging-Technologie gepaart mit einer Bildanalyse-Software, wurde festgestellt, dass Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 auf Tumor infiltrieren CD8+ T Zellen korreliert mit einer schlechten Prognose in RCC. Nach unserem Kenntnisstand entspricht dies die erste Studie, die zeigt, dass diese multiplex in Situ Technologie automatisiert einige klinischen Relevanz haben kann.
Introduction
In den letzten Jahren hat sich eine sehr vielversprechende Therapie für viele Arten von Krebs, einschließlich RCC Immuntherapie entwickelt. Besonders, Immuntherapie, basierend auf der Hemmung der hemmenden Prüfpunkte wie PD-1 und CTLA-4 wurde berichtet, werden klinisch wirksamen1,2,3,4,5, 6. monoklonale Antikörper gegen CTLA-4, PD-1 oder Programm Tod Liganden 1 (PD-L1) sind bereits in mehreren Krebserkrankungen zugelassen und zu lang anhaltende klinische Reaktionen in mehr als 20 % der Patienten7führen. Dennoch sind nicht alle Patienten Responder, die Kosten der Behandlung sind hoch und diese Behandlungen sind giftig, führt zu möglichen schweren Autoimmun-ähnliche Nebenwirkungen. Daher ist die aktuelle Herausforderung, prädiktive Marker für diese neue Immuntherapien zu identifizieren. Die Rate der Mutationen im Tumor, der Ausdruck der PD-L1 oder die Ebenen der intratumorale CD8+ T-Zell-Infiltration mit klinischem korrelieren gemeldet wurden. Diese Zuordnung ist jedoch immer noch zu schwach, um die Verwendung von diesen klinischen Biomarker in der klinischen Praxis mit Ausnahme der Begleiter-Test für PD-L1 vor der Verabreichung von Pembrolizumab in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebs Patienten8 empfehlen ,9,1011,12. Es wurde nachgewiesen, dass der Co Ausdruck der vielen inhibitorischen Rezeptoren wie PD-1, Tim-3, Lag-3 und CTLA-4, induziert eine Zelle Erschöpfung Phänotyp und Widerstand gegen die Therapie13,14,15. Da peripheren Blut nicht repräsentativ für die Tumor-Mikroumgebung, ist es von großem Interesse für die phänotypische Merkmale der Zellen in Situzu analysieren. PD-1 und Tim-3 zusammen mit dem Ausdruck ihrer T-Zellen sind bekanntermaßen funktionell beeinträchtigt Zellen in mehreren Kontexten13,16,17. In dieser Studie, die prognostische Auswirkungen der Co Ausdruck der zwei inhibitorischen Rezeptoren PD-1 und Tim-3 auf CD8+ T Zellen wurde bewertet.
Bis jetzt, Studium des Co Ausdrucks mehrere Markierungen auf Tumor infiltrieren Lymphozyten (TILs) wurde vor allem durch Flow Cytometry Analyse, macht es notwendig, auf frischen Tumoren und daher Ausschaltung Retrospektive Analysen arbeiten durchgeführt. Mit konventionellen in Situ beflecken, nur eine Färbung zu einem Zeitpunkt ausgeführt werden kann, und die Charakterisierung des Zelltyps, die die Marker Co ausdrückt ist nicht möglich. Z. B. PD-L1 drückt sich durch viele Zelltypen der Tumor Mikroumgebung, durch konventionelle immunhistochemische Analyse festlegen, welche Zellen mit dem Ausdruck PD-L1 desto relevanter für korrelative Studien erschwert. In dieser Arbeit entwickelten wir eine innovative in Situ multiparametric Immunfluoreszenz-Methode mit Computer zählen, um Co Ausdruck der PD-1 und Tim-3 durch Tumor infiltrieren CD8 korrelieren+ T-Zellen mit klinischen Resultaten im RCC. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, auf eine einzelne Zellenebene und mehrere Markierungen gleichzeitig mit einer multispektralen Kamera, die eingeschränkte Intervallen erfassen können zu analysieren > 10 nm durch Flüssigkristall filtert18. Darüber hinaus ist das Verfahren automatisch eine Inter-Operator-Reproduzierbarkeit und eine verkürzte Analyse im Vergleich zu manuellen Techniken19ermöglicht. Im Bereich Krebs berichteten mehrere Studien überzeugend mehrere Färbungen von immun-Moleküle wie PD-1, PD-L1 und CD8 in Merkel-Zell-Karzinom, Lungenkrebs und Kopf und Nacken Krebs20,21,22, 23. die automatisierte Zellzahl ist möglich mit der Ausbildung durch den Benutzer (Phänotypisierung Schritt). Die Fluoreszenz wird in die andere Zelle Fächer (Zellkerne, Zytoplasma und Membran) gemessen.
Hier, verschiedene Teilmengen der Tumor-Infiltration von CD8+ T-Zellen mit dem Ausdruck Ihrer PD-1 und/oder Tim-3 in einer großen Kohorte von RCC wurden gezählt und die Ergebnisse wurden mit klinischen Schwerkraft Partituren und überleben Parametern korreliert. Es war auch möglich, Membran Fluoreszenz-Intensität in der zellulären Auflösung bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) Daten wie Zytometrie zu analysieren. Soweit wir wissen, ist dies die erste Berichterstattung prognostische Studienergebnisse mit dieser multispektralen imaging basierend Graf-Technik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modifikationen und Fehlerbehebung:
Die Gewebe-Qualität ist ein wichtiger Parameter. Es kann leicht von Hämatoxylin und Eosin Färbung überprüft werden.
Ein Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit der gemultiplexten Keramikschalen, aber zur Vermeidung von Fluorophor Spillover empfohlen, um Emission Wellenlängen mit Delta von 10 nm mindestens zu wählen. Hier, weil wir 4 Keramikschalen einschließlich DAPI hatten, wir entschieden uns für die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue Contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex Immuno-Onkologie (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). EdG wurde durch ein Stipendium der Fondation ARC finanziert. EV und CD wurden durch ein Stipendium der APHP (Bourse Année recherche) finanziert. ChB ist durch ein Stipendium der Université Sorbonne Paris Cité (Contrat Doktoranden) finanziert. Die Autoren danken Bristol-Myers Squibb für ihre Finanzierung in diesem Projekt. Die Autoren danken die Abteilung für Pathologie des Hopital Européen Georges Pompidou und Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel und Gisèle Legall). Die Autoren danken die Histologie-Plattform von PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).
Materials
| Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging | Perkin Elmer | CLS142338 | |
| inForm cell analysis 2.1. | Perkin Elmer | CLS135781 | |
| R software | https://www.r-project.org | ||
| Dakopen delimiting pen | Dako | S2002 | |
| Tris Buffer Salin TBS Tablets | Takara, Bio Inc. | TAKT9141Z | pH7.6 100 tablet |
| Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20) | Takara, Bio Inc. | TAKT9142Z | pH 7.6 100 tablets |
| Biotin blocking system | Dako | X0590 | Avidin 0.1% and Biotin 0.01% |
| normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | 5% vol./vol. concentration |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-aldrich | F6057 | 1.5 µg/mL concentration |
| Knittel glass coverslip | Knittel Gläser, | 100039 | 24×60 mm 100 cover slips |
| Rabbit anti-CD8 Clone P17-V | novus | NBP1-79055 | use at 4µg/mL |
| Mouse anti-PD-1 Clone NAT | abcam | ab52587 | use at 2 µg/mL |
| Goat anti-Tim-3 | R&D | AF2365 | use at 3 µg/mL |
| Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142 | Roche | 7309457001 | use at 1 µg/mL |
| Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11 | Cell Signalling | 4528 | use at 0.5 µg/mL |
| Goat anti-human gal9 | R&D | AF2045 | use at 0.3 µg/mL |
| Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-175-152 | use at 5 µg/mL |
| Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 715-066-150 | use at 3 µg/mL |
| Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgG | abcam | ab150133 | use at 5 µg/mL |
| Cy3 labeled streptavidin | Amersham | PA43001 | use at 3 µg/mL |
| negative control mouse IgG1 | Dako | X0931 | use at 2 µg/mL |
| IgG from goat serum | Sigma-aldrich | I5256 | use at 3 µg/mL |
| IgG from rabbit serum | Sigma-aldrich | I5006 | use at 4µg/mL |
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