为了协调生长与环境, 植物已经进化了优雅的信号通路, 感知, 传感器, 并响应信号提示。就像接力赛中的赛跑者一样, 蛋白质是植物信号传导的必要参与者。人们普遍认识到蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 在细胞通讯中起着重要作用。蛋白质的磷酸化、再乙酰化和降解都依赖于靶蛋白与其修饰酶之间的物理相互作用。例如, 茉莉以域蛋白 (JAZ) 家族蛋白与转录因子 MYC2 相互作用并抑制其转录活性1,2。鉴于 PPI 的重要性, 植物中的 large-scale 蛋白 interactomes 最近已被探索3,4,5。这些 interactome 的结果进一步揭示了复杂的调控网络, 协调不同的细胞功能。
有一些既定的方法来监测 PPI。酵母两种杂交 (Y2H) 法是 PPI 检测中应用最广泛的方法。Y2H 很容易执行, 适合快速检测蛋白质相互作用。Y2H 也广泛用于筛选未知的交互合作伙伴的特定 protein-of-interest。然而, 由于 Y2H 完全是在酵母中进行的, 它不能反映植物细胞的真实情况, 并带来高假阳性率。另一个类似的策略是下拉法。一般来说, 两个蛋白质的表达和纯化从大肠杆菌细胞, 然后混合和固定的检测蛋白相互作用。虽然此方法不费时, 但它也无法获取在体内交互结果。对于体内交互目的, co-immunoprecipitation (co) 是最常用的检测方法, 它要求高质量的抗体 immunoprecipitate protein-of-interest, 不能排除间接质子的可能性。此外, 由于联合 IP 中的复杂实验程序, 结果通常与个人专长不同。
基于记者的重组分析大大推进了对体内PPI 的检测。这些方法包括荧光共振能量传递 (烦恼)6, 双荧光互补 (BiFC)7, 和萤火虫荧光互补成像 (的) 试验8。虽然这三种方法比 co 更好地反映直接的在体内PPI, 烦恼, 和 BiFC 需要特定的显微镜来检测荧光信号, 不能轻易量化的互动强度。相比之下, 该公司利用萤火虫荧光, 这将发光后与它的基底素反应。更重要的是, PPI 强度可以从荧光活动的价值来确定。因此, 它不仅表明两种蛋白质是否相互作用, 而且还提供了治疗时相互作用动力学的信息。虽然有一些建立的方法来监测交互动力学 (基于表面等离子体共振或热稳定转移)9,10, 这些方法需要微妙的仪器或特定的标签。相比之下, 它更易于执行和检测。
该方法的原理是将氨基末端和羧基末端的荧光 (分别命名为 n-卢克或 C-卢克) 与蛋白 A 和 B 融合, 并在植物细胞中同时表达这两种融合蛋白。如果蛋白质 a 与蛋白质 B 相互作用, 那么荧光的两个半部分将被重组为活性荧光酶。荧光活动可以通过计或 CCD 摄像头检测到。没有必要获得稳定的转化。瞬态表达式足以获得高质量的交互结果。
环型 E3 泛素连接本构 photomorphogenic 1 (COP1) 与无数转录因子相互作用, 通过26S 蛋白酶体11促进它们的降解。其中一些 COP1-targeted 转录因子是光的阳性调节剂。在黑暗中, COP1 与光敏 A-105 1 (SPA1) 的抑制器交互, 这增强了 COP1 E3 活动8。在对光的知觉之后, 光将废除 COP1-SPA1 相互作用抑制 COP1 活动, 然后稳定 COP1 基板12,13,14。这个例子说明了研究 ppi 和确定 ppi 动力学的生物学意义。