Luciferase complementatie Imaging Assay in Nicotiana benthamiana bladeren voor Transient bepalen eiwit-eiwit interactie Dynamics
Summary
Dit manuscript beschrijft een gemakkelijke en snelle experimentele procedure voor het bepalen van de eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op de meting van luciferase activiteit.
Abstract
Eiwit-eiwitinteractie zijn fundamentele mechanismen voor het doorgeven van signaaltransductie in meest cellulaire processen; Daarom zijn de identificatie van nieuwe eiwit-eiwit interactie pairs en eiwit interactie dynamiek controle van bijzonder belang voor het openbaren van hoe planten reageren op omgevingsfactoren en/of ontwikkelingsstoornissen signalen. Een overvloed aan benaderingen zijn ontwikkeld voor eiwit-eiwitinteractie, in vitro of in vivoonderzoeken. Onder hen is de onlangs opgerichte luciferase complementatie imaging (LCI) assay de eenvoudigste en snelste methode voor het aantonen van in vivo eiwit-eiwitinteractie. In deze test, is EiwitA of eiwit B gefuseerd met de amino-terminal of carboxyl-terminal helft van luciferase, respectievelijk. Wanneer EiwitA met eiwit B communiceert, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om te vormen van een functionele en actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden vastgelegd met een luminometer of CCD-camera. In vergelijking met andere benaderingen, toont de LCI assay eiwit-eiwitinteractie zowel kwalitatief als kwantitatief. Agrobacterium infiltratie in Nicotiana benthamiana bladeren is een veelgebruikt systeem voor voorbijgaande eiwit expressie. Met de combinatie van LCI en voorbijgaande expressie tonen deze benaderingen dat de fysieke interactie tussen COP1 en SPA1 geleidelijk was verminderd na de Jasmonaat behandeling.
Introduction
Oog op de coördinatie van groei met zijn omgeving, planten geëvolueerd tot elegante signaalroutes om te voelen, transduce en te reageren op signalen van de signalering. Zoals de lopers in een estafette zijn eiwitten nodig spelers in signaaltransductie van planten. Het is algemeen erkend dat eiwit-eiwit interactie (PPI) een belangrijke rol voor mobiele communicatie speelt. Proteïne fosforylatie, acetylation en afbraak zijn allemaal afhankelijk van de fysieke interactie tussen een doel-eiwit en haar wijzigen enzymen. Bijvoorbeeld, Jasmonate ZIM-domein eiwit (JAZ) familie eiwitten interactie met transcriptiefactor MYC2 en onderdrukken zijn transcriptionele activiteit1,2. Gezien het belang van PPI onderzocht grootschalige eiwit interactomes in fabrieken geweest onlangs3,4,5. Deze interactome resultaten verder onthullen de complexe regelgeving netwerk dat coördineert voor diverse cellulaire functies.
Er zijn enkele gevestigde benaderingen voor de controle van de PPI. De bepaling van gist twee hybride (Y2H) is de meest gebruikte methode voor de detectie van de PPI. Y2H is gemakkelijk uit te voeren, en geschikt voor een snelle test onderzocht eiwitinteractie. Y2H wordt ook op grote schaal gebruikt voor de screening van de onbekende wisselwerking partners voor de specifieke eiwit-of-interest. Echter omdat Y2H is geheel uitgevoerd in gist, kan niet zij nadenken het echte scenario in plantaardige cellen en brengt hoge valse positieve tarieven. Een andere soortgelijke strategie is de bepaling van de pull-down. In het algemeen twee eiwitten zijn uitgedrukt en gezuiverd van Escherichia coli cellen en vervolgens gemengd en geïmmobiliseerd voor het opsporen van eiwitinteractie. Hoewel deze methode niet tijdrovend is, niet kan het verkrijgen in vivo interactie resultaten ofwel. Voor in vivo de doeleinden van de interactie is co-immunoprecipitation (co-IP) de meest populaire assay, die houdt van hoge kwaliteit-antistoffen tegen immunoprecipitate de eiwit-of-interest en de mogelijkheid van indirecte PPIs kan niet worden uitgesloten. Bovendien, als gevolg van de ingewikkelde experimentele procedures in co-IP variëren de resultaten meestal met individuele expertise.
Verslaggever gebaseerd reconstitutie testen verder sterk de opsporing van in vivo PPI. Deze methoden omvatten de firefly luciferase complementatie imaging (LCI) assay8, fluorescentie resonance energy transfer (FRET)6en bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC)7. Hoewel deze drie benaderingen beter dan co-IP aan de directe in-vivo PPI, FRET en BiFC specifieke microscopen te detecteren signalen van de fluorescentie moeten en kunnen niet gemakkelijk kwantificeren van de intensiteit van de interactie. LCI maakt daarentegen gebruik van firefly luciferase, die gloeien zal na reageren met haar substraat luciferine. Nog belangrijker, kan PPI intensiteit worden bepaald uit de waarde van luciferase activiteit. LCI geeft dus niet alleen of de twee eiwitten interactie of niet, maar verstrekt ook informatie over de dynamiek van de interactie op een behandeling. Hoewel er enkele gevestigde methoden voor de controle van interactie dynamics (gebaseerd op oppervlakte plasmon resonantie of thermo-stabiliteit verschuivingen)9,10, betekent dit dat deze benaderingen gevoelige instrumenten of specifieke etikettering nodig. LCI is daarentegen eenvoudiger uit te voeren en te detecteren.
Het principe van LCI is dat de amino-terminal en carboxyl-terminal helften van luciferase (genaamd N-Luc of C-Luc, respectievelijk) waren gesmolten met EiwitA en B, en deze twee fusion eiwitten gelijktijdig werden uitgedrukt in plantencellen. Eiwit A communiceert met eiwit B, zal de twee helften van luciferase worden toegevoegd om een actieve luciferase enzym. Luciferase activiteit kan worden opgespoord met een luminometer of CCD-camera. Het is niet nodig voor het verkrijgen van stabiele transformants voor LCI; voorbijgaande expressie is genoeg om een kwalitatief hoogwaardige interactie resultaat te krijgen.
RING-type E3 ubiquitin ligase constitutieve photomorphogenic 1 (COP1) interageert met een horde van transcriptiefactoren en hun afbraak tot en met de 26S proteasoom11bevordert. Sommige van deze COP1-gerichte transcriptiefactoren zijn positieve regelgevers voor photomorphogenesis. In duisternis communiceert COP1 met suppressor van Phytochroom A-105 1 (SPA1), die COP1 E3 activiteit8verbetert. Na waarneming van licht, zal de researchdieren de COP1-SPA1 interactie vervolgens stabiliseren COP1 substraten12,13,14te COP1 activiteit remmen trekt. In het volgende voorbeeld illustreert de biologische betekenis van studeren PPI en het bepalen van de PPI dynamiek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven is eenvoudig en reproduceerbare voor het bestuderen van in vivo eiwit-eiwitinteractie en bijzonder geschikt voor het opsporen van eiwit interactie dynamiek onder exogene behandeling. De belangrijkste stap in deze test is N. benthamiana infiltratie. Infiltratie om succes te verzekeren, moet de planten zeer gezond. Een andere belangrijke factor is wanneer luciferase activiteit controleren na infiltratie. Er is geen juiste antwoord voor deze vraag. Onderzoekers worden aangemoed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20140919), de nationale Natural Science Foundation van China (31470375), de prioriteit academische programma ontwikkeling van Jiangsu instellingen voor hogeronderwijs en de Qing Lan Project.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
