Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.
Abstract
Protein-Protein-Interaktionen sind grundlegende Mechanismen zur Weiterleitung von Signaltransduktion in den zellulären Prozessen; Daher, Identifizierung von neuartigen Proteinprotein Interaktion Paare und Überwachung Proteindynamik Interaktion sind von besonderem Interesse für das aufdecken, wie Pflanzen auf Umweltfaktoren und/oder Entwicklungsstörungen Signale reagieren. Eine Fülle von Ansätzen wurde entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, in Vitro oder in Vivozu untersuchen. Unter ihnen ist die kürzlich ins Leben gerufene Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay die einfachste und schnellste Methode für den Nachweis der in Vivo Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Test ist Protein A oder B-Protein mit der amino-Terminal oder Carboxylgruppen-Terminal Hälfte des Luciferase, verschmolzen. Wenn Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine funktionelle und aktive Luciferase Enzym bilden. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera aufgezeichnet werden. Im Vergleich mit anderen Ansätzen, zeigt die LCI-Assay Protein-Protein-Interaktionen sowohl qualitativ als auch quantitativ. Agrobakterium Infiltration in Nicotiana Benthamiana Blättern ist ein weit verbreitetes System für transiente Proteinexpression. Mit der Kombination von LCI und transiente Expression zeigen dieser Ansätze, dass die körperliche Interaktion zwischen COP1 und SPA1 allmählich nach Jasmonat-Behandlung reduziert wurde.
Introduction
Um Wachstum mit seiner Umwelt zu koordinieren, haben Pflanzen entwickelt, elegante Signalwege spüren, transduzieren und Signalisierung Signale reagieren. Wie die Läufer in einem Staffellauf sind Proteine notwendig Spieler in der Pflanze Signaltransduktion. Es ist weithin anerkannt, dass Protein-Protein Wechselwirkung (PPI) eine wichtige Rolle für die zelluläre Kommunikation spielt. Protein-Phosphorylierung, Acetylierung und Abbau sind alle abhängig von physikalische Interaktion zwischen einem Zielprotein und seine modifizierende Enzyme. Z. B. Jasmonate ZIM-Domain Protein (JAZ) Familie Proteine interagieren mit Transkriptionsfaktor MYC2 und unterdrücken die transkriptionelle Aktivität1,2. Angesichts der Bedeutung der PPI erforschte große Protein Interactomes in Pflanzen wurden vor kurzem3,4,5. Diese Interaktom Ergebnisse weiter zeigen die komplexen regulatorischen Netzwerk, das diverse Zellfunktionen koordiniert.
Es gibt einige etablierte Ansätze für die Überwachung der PPI. Hefe-zwei-Hybrid (Y2H)-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Erkennung von PPI. Y2H ist einfach durchzuführen und eignet sich für einen schnellen Test, Protein-Interaktionen zu untersuchen. Y2H ist auch am meisten benutzt für das screening von unbekannten Interaktionspartner für das spezifische Protein von Interesse. Jedoch weil Y2H vollständig in der Hefe erfolgt, kann nicht es spiegeln die reale Szenario im Werk Zellen und bringt hohe falsch positiv Rate. Eine weitere ähnliche Strategie ist die Pulldown-Assay. In der Regel zwei Proteine sind zum Ausdruck gebracht und von Escherichia coli Zellen gereinigt und dann gemischt und immobilisiert zum Nachweis von Protein-Interaktionen. Obwohl diese Methode nicht zeitaufwändig ist, kann nicht es in Vivo Interaktion Ergebnisse entweder erhalten. Zwecken in Vivo Interaktion ist co-Immunopräzipitation (co-IP) die beliebtesten Assay, die qualitativ hochwertige Antikörper gegen Immunoprecipitate das Protein des Interesses erfordert und nicht ausgeschlossen, der indirekten PPI. Darüber hinaus variieren die Ergebnisse aufgrund der komplizierten experimentellen Verfahren in co-IP in der Regel mit individuellen Erfahrungen.
Reporter basierte Rekonstitution Assays fördern stark die Erkennung von in Vivo PPI. Diese Methoden umfassen Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)6, bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung (BiFC)7und die Glühwürmchen Luciferase Komplementierung imaging (LCI) Assay8. Diese drei Ansätze besser als co-IP entsprechend direkt in Vivo PPI, Bund und BiFC benötigen spezielle Mikroskope, Fluoreszenz-Signale zu erkennen und nicht einfach die Intensität der Interaktion quantifizieren. Im Gegensatz dazu nutzt LCI Firefly Luciferase, die nach der Reaktion mit seiner Substrat Luciferin Leuchten wird. Noch wichtiger ist, kann PPI Intensität vom Wert der Luciferase-Aktivität bestimmt werden. LCI gibt also nicht nur ob zwei Proteine interagieren oder nicht, sondern bietet auch Informationen über die Interaktion Dynamik bei der Behandlung. Zwar gibt es einige bewährten Methoden für die Überwachung der Interaktion Dynamik (basierend auf Oberflächen Plasmon Resonanz oder Thermo-Stabilität Verschiebungen)9,10, erfordern diese Ansätze empfindliche Instrumente oder spezifische Kennzeichnung. Im Gegensatz dazu ist LCI einfacher zu erkennen.
Das Prinzip für LCI ist, dass die amino-terminalen und Carboxylgruppen-Terminal Hälften der Luciferase (benannt N-Luc oder C-Luc) wurden fusioniert mit Protein A und B und diese zwei Schmelzverfahren Proteine wurden gleichzeitig in Pflanzenzellen ausgedrückt. Protein A mit B-Protein interagiert, werden die beiden Hälften der Luciferase wiederhergestellt werden, um eine aktive Luciferase Enzym sein. Luciferase-Aktivität kann mit einem Luminometer oder CCD-Kamera erkannt werden. Es ist nicht notwendig, stabile Transformanten für LCI zu erhalten; transiente Expression ist genug, um eine qualitativ hochwertige Interaktion Ergebnis zu erhalten.
RING-Typ E3 Ubiquitin Ligase konstitutive Photomorphogenic 1 (COP1) mit einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren interagiert und fördert deren Abbau durch die 26S Proteasom11. Einige von diesen COP1 ausgerichtete Transkriptionsfaktoren sind positive Regulatoren für Photomorphogenesis. In der Dunkelheit interagiert COP1 mit Suppressor Phytochrom a-105 1 (SPA1), die COP1 E3 Aktivität8verbessert. Nach Wahrnehmung des Lichts werden Photorezeptoren COP1 SPA1 Interaktion um COP1 Aktivität hemmen und dann stabilisieren COP1 Substrate12,13,14aufzuheben. Dieses Beispiel veranschaulicht die biologische Bedeutung der PPI zu studieren und die Bestimmung der PPI Dynamik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist einfach und reproduzierbar für das Studium in Vivo Protein-Protein-Interaktionen und besonders geeignet zur Erkennung von Proteindynamik Interaktion unter exogenen Behandlung. Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist N. Benthamiana Infiltration. Um Infiltration Erfolg zu gewährleisten, müssen die Pflanzen sehr gesund sein. Ein weiterer kritischer Faktor ist, wenn Luciferase Aktivität nach eindringen zu überprüfen. Es gibt keine richtige Antwort auf diese Frage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20140919), der National Natural Science Foundation of China (31470375), die Priorität akademischen Programm Entwicklung von Jiangsu Hochschuleinrichtungen und Qing Lan Projekt unterstützt.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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