Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина
Summary
Эта рукопись описывает простой и быстрый экспериментальной процедуры для определения белок белковых взаимодействий на основе измерения Люцифераза деятельности.
Abstract
Белок белковых взаимодействий являются основополагающие механизмы для передачи сигнала в наиболее клеточных процессов; Таким образом идентификация мониторинга динамики взаимодействия белков и Роман протеин взаимодействия пары представляют особый интерес для выявления как растения реагируют на факторы окружающей среды и/или развития сигналов. Множество подходов были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, в vitro или в естественных условиях. Среди них недавно созданной Люцифераза комплементарности изображений (LCI) пробирного является простой и быстрый метод для демонстрации в естественных условиях белок белковых взаимодействий. В этот assay белок или белков B сливается с амино терминал или карбоксильных терминал половины Люцифераза, соответственно. Когда белок взаимодействует с белком B, две половинки Люцифераза будет преобразован для формирования функциональных и активных Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть записаны с помощью люминометра или ПЗС камеры. По сравнению с другими подходами, LCI assay показывает белок белковых взаимодействий, как качественно, так и количественно. Agrobacterium инфильтрации в листьях Nicotiana benthamiana является широко используемой системой для переходных белков. С сочетание LCI и переходных выражения эти подходы показывают, что физическое взаимодействие между КС1 и SPA1 было постепенно сокращено после Жасмонат лечения.
Introduction
Для того, чтобы координировать роста с окружающей средой, растения эволюционировали элегантный сигнальные пути чувство, передают и реагировать сигнализации сигналы. Как бегунов в эстафете белки являются необходимыми игроков в сигнальной трансдукции растений. Было широко признано, что взаимодействия протеин протеина (PPI) играет важную роль для сотовой связи. Все зависит от физического взаимодействия между целевого белка и его модификация ферментов фосфорилирование белков, ацетилирования и деградации. Например Жасмонат зим домен белка (JAZ) семьи белки взаимодействуют с транскрипционным фактором MYC2 и подавить его транскрипционный анализ активности1,2. Учитывая важное значение PPI крупномасштабные белков, которые были interactomes в растениях изучить недавно3,4,5. Эти interactome результаты далее свидетельствуют о сложных регулирования сети, которая координирует различные клеточные функции.
Есть некоторые установленные подходы для наблюдения за PPI. Assay дрожжей два гибридных (Y2H) является наиболее широко используемым методом для обнаружения PPI. Y2H легко выполнить и подходит для быстрой проверки для изучения взаимодействия протеина. Y2H также широко используется для скрининга неизвестные взаимодействия партнеров для определенного протеина интереса. Однако потому что Y2H полностью осуществляется в дрожжи, он не может отражать реальный сценарий в заводе клетки и приносит высокий уровень ложных положительных. Еще одна аналогичная стратегия является выпадающее assay. В общем две белки являются выразил и очищенного от клеток Escherichia coli и затем смешанные и прикол для обнаружения взаимодействия протеина. Хотя этот метод не требует много времени, он не может получить в естественных условиях результаты взаимодействия либо. Для целей взаимодействия в естественных условиях co иммунопреципитация (co-IP) является наиболее популярным assay, которое требует высокого качества антитела к immunoprecipitate протеин интереса и нельзя исключать возможность косвенного ИЦП. Кроме того из-за сложных экспериментальных процедур в co-IP, результаты обычно зависит от индивидуального опыта.
Журналистом воссоздание анализов сильно заранее обнаружения в vivo PPI. Эти методы включают в себя флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА)6, bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ)7и Светлячок Люцифераза дополнения изображений (LCI) пробирного8. Хотя эти три подхода являются лучше, чем co-IP отразить непосредственно в vivo PPI, ладу и БМФЦ нужны конкретные микроскопы для обнаружения сигналов флуоресценции и не может легко количественно интенсивности взаимодействия. В отличие от LCI использует Светлячок Люцифераза, которая будет светиться после реакцию с его люциферин субстрата. Что еще более важно PPI интенсивности может быть определена из значения Люцифераза деятельности. Таким образом LCI не только указывает ли две белки взаимодействовать или нет, но также предоставляет информацию о динамике взаимодействия после лечения. Хотя есть некоторые установленные методы для контроля взаимодействия динамики (на основе поверхностного плазмон резонанса или термо стабильность смены)9,10, эти подходы требуют чувствительные инструменты или конкретных маркировки. В отличие от LCI легче выполнить и обнаружить.
Принцип для LCI это амино- и карбоксильной терминал половинки Люцифераза (называется N-Люк или C-люк, соответственно) были слиты с протеин A и B и эти два синтез белков одновременно были выражены в клетках растений. Если протеин A взаимодействует с белком B, затем две половинки Люцифераза будет преобразован для активного Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть обнаружены с помощью люминометра или ПЗС камеры. Это не является необходимым для получения стабильной трансформантов для LCI; переходных выражение является достаточно, чтобы получить результат высокого качества взаимодействия.
КОЛЬЦО типа E3 убиквитин лигаза учредительного photomorphogenic 1 (КС1) взаимодействует с множеством факторов транскрипции и способствует их деградации через 26S протеасом11. Некоторые из этих факторов транскрипции, ориентированные на КС1 являются положительные регуляторы для photomorphogenesis. В темноте КС1 взаимодействует с супрессорной фитохрома A-105 1 (SPA1), который повышает КС1 E3 деятельности8. После восприятие света фоторецепторов будет отменить взаимодействие КС1-SPA1 ингибируют активность КС1 и затем стабилизировать КС1 субстратов12,,1314. Этот пример иллюстрирует биологическое значение изучения ИЦП и определение динамики PPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь простой и воспроизводимый для изучения в естественных условиях белок белковых взаимодействий и особенно подходит для выявления динамики взаимодействия белков под экзогенными лечения. Ключевым шагом в этот assay является проникновение N. benthamiana . Для о?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана естественных наук фонд провинции Цзянсу (BK20140919), Национальный фонд Китая естественных наук (31470375), приоритет академические программы развития Цзянсу высших учебных заведений и Цин Интернет проекта.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
