לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה
Summary
כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.
Abstract
אינטראקציות חלבון-חלבון הם מנגנוני היסוד ממסר אותות ב תהליכים תאיים ביותר; לכן, זיהוי של זוגות אינטראקציית חלבון הרומן וניטור dynamics אינטראקציית חלבון הן עניין מיוחד לחשוף כיצד צמחים מגיבים גורמים סביבתיים ו/או אותות התפתחותית. שפע של גישות פותחו כדי לבדוק אינטראקציות חלבון-חלבון, או בתוך חוץ גופית או ויוו. ביניהם, קומפלמנטציה לוציפראז הוקמה לאחרונה הדמיה (LCI) וזמינותו היא השיטה הפשוטה והמהירה על הפגנת ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון. ב הזה assay, חלבון א’ או חלבון B הוא התמזגו עם החצי אמינו-מסוף או carboxyl-מסוף של לוציפראז, בהתאמה. כאשר חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, מחדש את שני החצאים של לוציפראז כדי ליצור אנזים לוציפראז פונקציונלי ופעיל. ניתן לרשום לוציפראז פעילות luminometer או של מצלמות-מצלמה. לעומת גישות אחרות, וזמינותו LCI מראה אינטראקציות חלבון-חלבון איכותית והן באופן כמותי. Agrobacterium חדירה טבק benthamiana העלים היא מערכת בשימוש נרחב עבור ביטוי חלבון ארעית. עם השילוב של LCI וביטוי ארעי, גישות אלה מראים כי האינטראקציה הפיזי בין COP1 SPA1 צומצם בהדרגה לאחר הטיפול יסמונט.
Introduction
על מנת לתאם צמיחה עם סביבתו, הצמחים התפתחו אלגנטי איתות המסלולים לחוש, מגלי, ולהגיב רמזים איתות. כמו הרצים במירוץ שליחים, חלבונים הם שחקנים הכרחי צמח מעבר אותות. זה הוכרה נרחב אינטראקציית חלבון-חלבון (PPI) ממלא תפקיד חשוב לקשר סוללרי. זירחון חלבונים, acetylation, והשפלה תלויים כל מגע פיזי בין חלבון המטרה ואנזימים שינוי שלה. לדוגמה, חלבונים משפחה של חלבון (ג’אז) יסמונט צים-תחום אינטראקציה עם גורם שעתוק MYC2, לדכא את פעילות גנים ברמת השעתוק1,2. לאור החשיבות של PPI, חלבון בקנה מידה גדול interactomes בצמחים כבר בחנו לאחרונה3,4,5. תוצאות interactome אלו עוד יותר לחשוף את הרשת רגולטוריות מורכבות מרכזת תאיים מגוונות.
יש כמה גישות הוקמה עבור ניטור PPI. שמרים שני וזמינותו היברידית (Y2H) היא השיטה הנפוצה ביותר לגילוי PPI. Y2H הוא קל לביצוע, מתאים בדיקה מהירה לבדוק אינטראקציות חלבון. Y2H הוא גם משמש לסינון שותפים אינטראקציה לא ידוע עבור ספציפיים החלבון-של-הריבית. עם זאת, מכיוון Y2H מתבצעת לחלוטין בשמרים, זה אינו יכול לשקף התרחיש האמיתי בצמח תאים, מביא תעריפים חיובי כוזב. האסטרטגיה דומה נוספת היא וזמינותו נפתחים. באופן כללי, שני חלבונים הם הביעו מטוהרים מתאי Escherichia coli ו מעורב ואז מתאושש לגילוי אינטראקציות חלבון. למרות ששיטה זו אינה אורכת זמן רב, באפשרותו לקבל ויוו תוצאות האינטראקציה גם. למטרות ויוו אינטראקציה, co-immunoprecipitation (co-IP) הוא וזמינותו הפופולרי ביותר, אשר דורש נוגדן באיכות גבוהה כדי immunoprecipitate החלבון-של-הריבית לא יכול לפסול את האפשרות של להדברה עקיף. יתר על כן, בשל ההליכים ניסויי הסבוכים ב- co-IP, התוצאות בדרך כלל משתנות עם מומחיות בודדים.
מבחני שיחזור כתב מבוסס במידה רבה מראש הזיהוי ויוו PPI. שיטות אלה כוללות פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6, זריחה ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC)7ו את גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה assay (LCI)8. אמנם אלה שלוש גישות יותר co-IP כדי לשקף את ישירה ויוו PPI, סריג, BiFC צריך מיקרוסקופ ספציפי כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית אותות, בקלות לא יכול לכמת את עוצמת האינטראקציה. לעומת זאת, LCI מנצל גחלילית לוציפראז, אשר יווצר מצב לאחר מגיבים luciferin המצע שלה. חשוב יותר, עוצמת PPI יכול להיקבע מהערך של לוציפראז פעילות. לפיכך, LCI מציין לא רק אם שני חלבונים אינטראקציה או לא, אך מספק מידע על הדינמיקות אינטראקציה בעת הטיפול. אמנם יש כמה שיטות הוקמה עבור ניטור אינטראקציה דינמיקה (מבוסס על משטח פלזמון תהודה או תרמו-יציבות משמרות)9,10, גישות אלה דורשות כלים עדינים או תיוג ספציפית. לעומת זאת, LCI קל לבצע ולגלות.
העיקרון של LCI זה החצאים אמינו-מסוף, carboxyl-מסוף של לוציפראז (בשם N-לוק או C-לוק, בהתאמה) היו התמזגו עם חלבון A ו- B, אלה היתוך שני חלבונים היו בו זמנית לידי תאי צמחים. אם חלבון A אינטראקציה עם חלבון B, להיות מחדש את שני החצאים של לוציפראז להיות אנזים לוציפראז פעיל. לוציפראז פעילות יכול להתגלות עם luminometer או מצלמת CCD. זה לא הכרחי כדי לקבל transformants יציב LCI; הביטוי ארעי מספיקה כדי להשיג תוצאה אינטראקציה באיכות גבוהה.
סוג הטבעת E3 אוביקוויטין ליגאז קונסטיטוטיביות photomorphogenic 1 (COP1) אינטראקציה עם מספר עצום של גורמי שעתוק ומקדם שפלותם דרך ה 26 פרוטאוזום11. כמה גורמי שעתוק, ממוקדות COP1 אלה הם חיוביים לשסתומי פוטומורפוגנזה. באפלה, COP1 מקיים אינטראקציה עם משתיק קול של פיטוכרום A-105 1 (SPA1), אשר מגביר פעילות COP1 E38. לאחר תפיסת האור, photoreceptors ביטל את האינטראקציה COP1-SPA1 לעכב פעילות COP1 ו אז תייצב COP1 סובסטרטים12,13,14. דוגמה זו ממחישה את משמעות ביולוגית לומד PPI וקביעת PPI dynamics.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט, ללמוד ויוו אינטראקציות חלבון-חלבון, הדירים מתאים במיוחד לגילוי חלבון dynamics אינטראקציה תחת טיפול אקסוגני. הצעד מפתח זה וזמינותו היא חדירה benthamiana ש . כדי להבטיח הצלחה הסתננות, הצמחים להיות בריא מאוד. גורם קריטי נוסף הוא מתי לבדוק פעילות לוציפראז לאחר חד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי את מדעי הטבע קרן של מחוז ג’יאנגסו (BK20140919) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31470375), עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג’יאנגסו מוסדות להשכלה גבוהה, צ’ינג Lan הפרוייקט.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
