Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina
Summary
Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell’attività luciferasica.
Abstract
Interazioni proteina-proteina sono meccanismi fondamentali per l’inoltro della trasduzione del segnale nei processi più cellulari; Pertanto, identificazione delle coppie di interazione proteina-proteina novella e dinamiche di interazione della proteina di monitoraggio sono di particolare interesse per rivelare come le piante rispondono ai fattori ambientali e/o segnali inerente allo sviluppo. Una pletora di approcci sono stati sviluppati per esaminare le interazioni proteina-proteina, sia in vitro che in vivo. Tra questi, la complementazione di luciferase recentemente stabilito imaging (LCI) analisi è il metodo più semplice e veloce per la dimostrazione in vivo interazioni proteina-proteina. In questo test, proteina A o proteina B si fonde con la metà amino-terminale o carbossi-terminale della luciferasi, rispettivamente. Quando la proteina A interagisce con la proteina B, le due metà della luciferasi verrà ricostituita per formare un enzima luciferasi funzionale e attivo. L’attività luciferasica può essere registrato con un luminometro o la telecamera CCD. Rispetto ad altri approcci, il dosaggio LCI Mostra interazioni proteina-proteina sia qualitativamente che quantitativamente. L’infiltrazione di Agrobacterium in foglie di Nicotiana benthamiana è un sistema ampiamente utilizzato per l’espressione della proteina transitoria. Con la combinazione di LCI ed espressione transiente, questi approcci mostrano che l’interazione fisica tra COP1 e SPA1 è stata gradualmente ridotta dopo il trattamento jasmonato.
Introduction
Al fine di coordinare la crescita con il suo ambiente, le piante hanno sviluppato eleganti vie di segnalazione per percepire, trasduce e rispondere ai segnali di segnalazione. Come i corridori in una gara a staffetta, le proteine sono necessari giocatori nella trasduzione del segnale di pianta. È stato ampiamente riconosciuto che l’interazione proteina-proteina (PPI) svolge un ruolo importante per la comunicazione cellulare. Degradazione, acetilazione e fosforilazione della proteina dipendono tutti dalla interazione fisica tra una proteina dell’obiettivo e suoi enzimi di modificazione. Ad esempio, proteine della famiglia di Jasmonate ZIM-dominio della proteina (JAZ) interagiscono con il fattore di trascrizione MYC2 e sopprimono la sua attività trascrizionale1,2. Data l’importanza di PPI, su grande scala della proteina Interattomi nelle piante sono state recentemente esplorato3,4,5. Questi risultati Interactoma ulteriormente rivelano la complessa rete di regolamentazione che coordina diverse funzioni cellulari.
Ci sono alcuni approcci stabiliti per il monitoraggio di PPI. Il dosaggio di lievito due ibridi (Y2H) è il metodo più utilizzato per il rilevamento di PPI. Y2H è facile da eseguire e adatto per un rapido test esaminare le interazioni della proteina. Y2H è anche ampiamente usato per lo screening di partners di interazione sconosciuto per la proteina di interesse specifico. Tuttavia, poiché Y2H è interamente realizzato in lievito, non può riflettere lo scenario reale in pianta cellule e porta alto tasso di falsi positivi. Un’altra strategia simile è il test di discesa. In generale, due proteine sono espresse e purificati da cellule di Escherichia coli e quindi misto e immobilizzati per rilevare le interazioni della proteina. Anche se questo metodo non è che richiede tempo, non è possibile ottenere in vivo risultati di interazione sia. Per scopi di interazione in vivo , co-immunoprecipitazione (co-IP) è il test più popolare, che richiede dell’anticorpo di alta qualità a immunoprecipitate la proteina di interesse e non può escludere la possibilità di PPIs indiretta. Inoltre, a causa di complicate procedure sperimentali in co-IP, i risultati variano solitamente con competenze individuali.
Saggi di ricostituzione reporter basato avanzano notevolmente il rilevamento di in vivo PPI. Questi metodi includono fluorescenza resonance energy transfer (FRET)6, fluorescenza bimolecolare complementazione (BiFC)7e la complementazione di firefly luciferase imaging (LCI) dosaggio8. Anche se questi tre approcci sono meglio di co-IP per riflettere il diretto in vivo PPI, FRET e BiFC bisogno specifici microscopi per rilevare segnali di fluorescenza e facilmente non può quantificare l’intensità di interazione. Al contrario, LCI si avvale della luciferasi firefly, che si illuminerà dopo reagendo con sua luciferina di substrato. Ancora più importante, intensità PPI può essere determinato dal valore dell’attività luciferasica. Così, LCI non solo indica se due proteine interagiscono o non, ma fornisce anche informazioni sulle dinamiche di interazione sul trattamento. Anche se ci sono alcuni metodi stabiliti per il monitoraggio di interazione dinamica (basata su turni di stabilità termica o risonanza plasmonica di superficie)9,10, questi approcci richiedono strumenti delicati o etichettatura specifica. Al contrario, LCI è più facile da eseguire e rilevare.
Il principio per LCI è che le metà amino-terminale e carbossi-terminale della luciferasi (denominato N-Luc o C-Luc, rispettivamente) sono stati fusi con proteina A e B e questi due fusione proteine contemporaneamente sono state espresse nelle cellule vegetali. Se la proteina A interagisce con la proteina B, quindi le due metà della luciferasi verrà ricostituita per essere un enzima luciferasi attivo. L’attività luciferasica può essere rilevato con un luminometro o la telecamera CCD. Non è necessario ottenere trasformanti stabili per LCI; l’espressione transitoria è sufficiente per ottenere un risultato di alta qualità di interazione.
ANELLO-tipo E3 ubiquitina ligasi costitutiva fotomorfogeniche 1 (COP1) interagisce con una miriade di fattori di trascrizione e promuove la loro degradazione attraverso il proteasoma 26S11. Alcuni di questi fattori di trascrizione COP1-mirati sono regolatori positivi per fotomorfogenesi. Nel buio, COP1 interagisce con soppressore di Fitocromo A-105 1 (SPA1), che esalta la COP1 E3 attività8. Dopo la percezione della luce, fotorecettori si abolisce l’interazione COP1-SPA1 per inibire l’attività COP1 e quindi stabilizzare COP1 substrati12,13,14. Questo esempio illustra il significato biologico di studiare PPI e determinare dinamiche PPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui è semplice e riproducibile per studiare in vivo interazioni proteina-proteina e particolarmente adatto per la rilevazione di dinamiche di interazione della proteina sotto trattamento esogeno. Il passo fondamentale in questa analisi è N. benthamiana infiltrazione. Per garantire il successo di infiltrazione, le piante devono essere molto sani. Un altro fattore critico è quando controllare l’attività luciferasica dopo infiltrazione. Non c’è nessuna risposta corretta a quest…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione con scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20140919), National Natural Science Foundation of China (31470375), la priorità programma sviluppo di Jiangsu istruzione superiore istituzioni accademiche e Qing Lan Project.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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