Luciferase निकोटियाना benthamiana में पूरक इमेजिंग परख क्षणिक प्रोटीन प्रोटीन संपर्क गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए छोड़ देता है
Summary
इस पांडुलिपि luciferase गतिविधि की माप के आधार पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का निर्धारण करने के लिए एक आसान और तेजी से प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन ।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं में संकेत transduction रिले के लिए बुनियादी तंत्र हैं; इसलिए, उपंयास प्रोटीन प्रोटीन संपर्क जोड़े और निगरानी प्रोटीन संपर्क गतिशीलता की पहचान कैसे पौधों पर्यावरणीय कारकों और/या विकास के संकेतों का जवाब बताने के लिए विशेष रुचि के हैं । दृष्टिकोण के ढेर सारे प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए विकसित किया गया है, या तो इन विट्रो में या vivo में। उनमें से, हाल ही में स्थापित luciferase पूरक इमेजिंग (LCI) परख vivo प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत में प्रदर्शन के लिए सबसे सरल और तेजी से विधि है । इस परख में, प्रोटीन एक या प्रोटीन बी अमीनो के साथ जुड़े हुए है-टर्मिनल या carboxyl-luciferase के टर्मिनल आधा, क्रमशः । जब प्रोटीन एक प्रोटीन बी के साथ सूचना का आदान प्रदान, luciferase के दो हिस्सों के लिए एक कार्यात्मक और सक्रिय luciferase एंजाइम फार्म का पुनर्गठन किया जाएगा । Luciferase गतिविधि एक luminometer या सीसीडी-कैमरा के साथ दर्ज किया जा सकता है । अंय दृष्टिकोण के साथ तुलना में, LCI परख प्रोटीन-प्रोटीन दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक बातचीत से पता चलता है । निकोटियाना benthamiana पत्तियों में एग्रोबेक्टीरियम घुसपैठ क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रणाली है । LCI और क्षणिक अभिव्यक्ति के संयोजन के साथ, इन तरीकों से पता चलता है कि COP1 और SPA1 के बीच शारीरिक संपर्क धीरे-jasmonate उपचार के बाद कम हो गया था ।
Introduction
आदेश में अपने पर्यावरण के साथ विकास के समंवय के लिए, पौधों को भावना, transduce सुरुचिपूर्ण संकेतन रास्ते विकसित किया है, और संकेत cues का जवाब । एक रिले दौड़ में धावकों की तरह, प्रोटीन संयंत्र संकेत transduction में आवश्यक खिलाड़ी हैं । यह व्यापक रूप से मांयता दी गई है कि प्रोटीन प्रोटीन संपर्क (पीपीआई) सेलुलर संचार के लिए एक प्रमुख भूमिका निभाता है । प्रोटीन फास्फारिलीकरण, acetylation, और गिरावट सभी एक लक्ष्य प्रोटीन और उसके संशोधित एंजाइमों के बीच शारीरिक संपर्क पर निर्भर हैं । उदाहरण के लिए, Jasmonate ZIM-डोमेन प्रोटीन (झझ) परिवार के प्रोटीन प्रतिलेखन कारक MYC2 के साथ बातचीत और उसके transcriptional गतिविधि1,2को दबाने । पीपीआई के महत्व को देखते हुए पौधों में बड़े पैमाने पर प्रोटीन interactomes हाल ही में3,4,5का पता लगाया गया है । इन interactome परिणाम आगे जटिल नियामक नेटवर्क है कि विविध सेलुलर कार्यों निर्देशांक प्रकट करते हैं ।
पीपीआई की निगरानी के लिए कुछ स्थापित दृष्टिकोण हैं । खमीर दो संकर (Y2H) परख पीपीआई पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । Y2H करने के लिए आसान है, और एक त्वरित परीक्षण के लिए उपयुक्त करने के लिए प्रोटीन बातचीत की जांच । Y2H भी व्यापक रूप से विशिष्ट प्रोटीन के हित के लिए अज्ञात बातचीत भागीदारों स्क्रीनिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, क्योंकि Y2H पूरी तरह से खमीर में किया जाता है, यह संयंत्र कोशिकाओं में वास्तविक परिदृश्य को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते है और उच्च झूठी सकारात्मक दरों लाता है । इसी तरह की एक और रणनीति को खींच-परख रहे हैं । सामांय में, दो प्रोटीन व्यक्त कर रहे है और ई कोलाई कोशिकाओं से शुद्ध और फिर मिश्रित और प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए मैटीरियल । हालांकि इस विधि समय लेने वाली नहीं है, यह vivo में संपर्क परिणाम या तो प्राप्त नहीं कर सकते । के लिए vivo बातचीत प्रयोजनों में , सह immunoprecipitation (सह आईपी) सबसे लोकप्रिय परख है, जो उच्च गुणवत्ता एंटीबॉडी की आवश्यकता है immunoprecipitate के लिए प्रोटीन के हित और अप्रत्यक्ष PPIs की संभावना को बाहर नहीं कर सकते । इसके अलावा, सह में जटिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के कारण आई पी, परिणाम आम तौर पर व्यक्तिगत विशेषज्ञता के साथ बदलती हैं ।
रिपोर्टर आधारित पुनर्गठन परख बहुत vivo पीपीआई में का पता लगाने के अग्रिम । इन तरीकों प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट)6, bimolecular प्रतिदीप्ति पूरक (BiFC)7, और जुगनू luciferase पूरक इमेजिंग (LCI) परख8शामिल हैं । हालांकि इन तीन दृष्टिकोण से बेहतर है सह आईपी को प्रतिबिंबित करने के लिए vivo पीपीआई, झल्लाहट में प्रत्यक्ष, और BiFC प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए विशिष्ट सूक्ष्मदर्शी की जरूरत है और आसानी से बातचीत की तीव्रता नहीं कर सकते । इसके विपरीत, LCI जुगनू luciferase, जो अपने सब्सट्रेट luciferin के साथ प्रतिक्रिया के बाद चमक जाएगा का लाभ लेता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, पीपीआई तीव्रता luciferase गतिविधि के मूल्य से निर्धारित किया जा सकता है । इस प्रकार, LCI न केवल इंगित करता है कि दो प्रोटीन बातचीत या नहीं, लेकिन यह भी उपचार पर संपर्क गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हालांकि वहां की निगरानी के लिए कुछ स्थापित तरीके है संपर्क गतिशीलता (सतह plasmon अनुनाद या थर्मामीटरों-स्थिरता बदलाव के आधार पर)9,10, इन तरीकों नाजुक उपकरणों या विशिष्ट लेबल की आवश्यकता है । इसके विपरीत, LCI प्रदर्शन और पता लगाने के लिए आसान है ।
LCI के लिए सिद्धांत यह है कि एमिनो टर्मिनल और carboxyl-टर्मिनल luciferase के हिस्सों (एन ल्यूक या सी-ल्यूक, क्रमशः) प्रोटीन ए और बी के साथ जुड़े हुए थे, और इन दो फ्यूजन प्रोटीन एक साथ संयंत्र कोशिकाओं में व्यक्त किए गए । प्रोटीन बी के साथ एक इंटरैक्ट करता है, तो luciferase के दो हिस्सों एक सक्रिय luciferase एंजाइम होने के लिए पुनर्गठन किया जाएगा । Luciferase गतिविधि एक luminometer या सीसीडी-कैमरा के साथ पता लगाया जा सकता है । यह LCI के लिए स्थिर transformants प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है; परिवर्तनीय अभिव्यक्ति एक उच्च गुणवत्ता वाले संपर्क परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
अंगूठी प्रकार E3 ubiquitin ligase गठन photomorphogenic 1 (COP1) प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत करता है और 26S proteasome11के माध्यम से उनके क्षरण को बढ़ावा देता है । इन COP1 के कुछ लक्षित प्रतिलेखन कारकों photomorphogenesis के लिए सकारात्मक नियामकों हैं । अंधकार में, COP1 phytochrome के दमन के साथ इंटरैक्ट करता है A-१०५ १ (SPA1), जो COP1 E3 गतिविधि को बढ़ाता है 8. प्रकाश की धारणा के बाद, photoreceptors COP1 गतिविधि को बाधित और फिर COP1 सब्सट्रेट12,13,14स्थिर करने के लिए COP1-SPA1 संपर्क निराकृत होगा । इस उदाहरण के अध्ययन पीपीआई के जैविक महत्व और पीपीआई गतिशीलता का निर्धारण दिखाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित सरल और प्रतिलिपि है vivo प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत में अध्ययन के लिए, और विशेष रूप से उपयुक्त exogenous उपचार के तहत प्रोटीन संपर्क गतिशीलता का पता लगाने के लिए । इस परख में महत्वपूर्ण कद?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Jiangsu प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (BK20140919), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४७०३७५), Jiangsu उच्च शिक्षा संस्थानों और किंग लैन परियोजना के प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम के विकास के द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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