Luciferas komplettering Imaging test i Nicotiana benthamiana blad för övergående bestämma Protein-protein interaktioner Dynamics
Summary
Detta manuskript beskriver en enkel och snabb experimentell metod för att bestämma protein-protein interaktioner baserat på mätning av luciferas aktivitet.
Abstract
Protein-protein interaktioner är grundläggande mekanismer för återutläggning signaltransduktion i mest cellulära processer; identifiering av romanen protein-protein interaktioner par och övervakning protein interaktion dynamics är därför av särskilt intresse för att avslöja hur växter bemöta miljöfaktorer eller utvecklingsmässiga signaler. En uppsjö av metoder har utvecklats för att undersöka protein-protein interaktioner, antingen in vitro eller in-vivo. Bland dem är nyligen inrättade luciferas komplettering imaging (LCI) analys den enklaste och snabbaste metoden för att demonstrera i vivo protein-protein interaktioner. I denna analys, är protein A eller protein B fixerade med amino-terminal eller karboxylgrupp-terminal halvåret luciferas, respektive. När protein A interagerar med protein B, kommer de två halvorna av luciferas beredas för att bilda en fungerande och aktiv luciferas enzym. Luciferas aktivitet kan registreras med en luminometer eller CCD-kamera. Jämfört med andra tillvägagångssätt, visar LCI analysen protein-protein interaktioner både kvalitativt och kvantitativt. Agrobacterium infiltration i Nicotiana benthamiana blad är en allmänt använd system för övergående proteinuttryck. Med kombinationen av LCI och övergående uttryck visar dessa metoder att det fysiska samspelet mellan COP1 och SPA1 minskade gradvis efter jasmonate behandling.
Introduction
För att samordna tillväxt med dess miljö, utvecklats växter eleganta signalvägar för att känna, transduce, och reagera på signalering ledtrådar. Som löpare i ett stafettlopp är proteiner nödvändiga spelare i växten signaltransduktion. Det har varit allmänt kända att protein-protein interaktioner (PPI) spelar en viktig roll för mobil kommunikation. Protein fosforylering, acetylering och nedbrytning är alla beroende av fysisk interaktion mellan ett målprotein och dess modifiera enzymer. Exempelvis Jasmonate ZIM-domän protein (JAZ) familj proteiner interagerar med transkriptionsfaktor MYC2 och undertrycka sin transkriptionell aktivitet1,2. Med tanke på betydelsen av PPI utforskat storskaliga protein interactomes i växter har nyligen3,4,5. Dessa interactome-resultat ytterligare avslöja det komplexa regulatoriska nätverk som samordnar olika cellulära funktioner.
Det finns vissa etablerade metoder för övervakning av PPI. Den jäst två hybrid (Y2H)-analysen är den mest använda metoden för PPI upptäckt. Y2H är lätt att utföra, och lämpar sig för en snabb test att undersöka proteininteraktioner. Y2H är också allmänt används för screening okänd interaktion partners för den specifika protein-of-intressen. Dock eftersom Y2H utförs helt i jäst, kan inte det återspeglar det verkliga scenariot i växten celler och ger hög falska positiva priser. En annan liknande strategi är den pull-down-analysen. I allmänhet två proteiner uttrycks och renas från Escherichia coli celler och sedan blandas och orörlig för att upptäcka proteininteraktioner. Även om denna metod inte är tidskrävande, erhålla inte i vivo interaktion resultat heller. För i vivo interaktion ändamål är co-immunoprecipitation (co-IP) den mest populära assay, som kräver hög kvalitet antikroppar mot immunoprecipitate den protein-of-intressen och kan inte utesluta möjligheten av indirekta protonpumpshämmare. Dessutom, på grund av de komplicerade experimentella rutiner i co-IP, resultaten varierar oftast med individuellt expertis.
Reporter baserad beredning analyser avancerar kraftigt detektion av i vivo PPI. Dessa metoder inkluderar fluorescens resonans energi överföring (bandet)6, bimolecular fluorescens komplettering (BiFC)7och firefly luciferas komplettering imaging (LCI) assay8. Även om dessa tre metoder är bättre än co-IP spegla den direkt i vivo PPI, bandet och BiFC behöver särskilda Mikroskop till upptäcka fluorescens signaler och kan inte enkelt kvantifiera interaktion intensiteten. Däremot tar LCI fördel av firefly luciferas, som kommer att lysa efter reagerar med dess substrat luciferin. Viktigare, kan PPI intensitet bestämmas från värdet av luciferas aktivitet. LCI visar således inte bara om två proteiner interagerar eller inte, men också ger information om interaktionen dynamiken vid behandling. Även om det finns några etablerade metoder för övervakning av interaktion dynamics (baserat på ytan plasmon resonans eller thermo-stabilitet skift)9,10, kräver dessa metoder känsliga instrument eller särskilda märkning. LCI är däremot lättare att utföra och upptäcka.
Principen för LCI är att de amino-terminal och karboxylgrupp-terminal halvorna av luciferas (namnet N-Luc eller C-Luc, respektive) fixerades med protein A och B, och dessa två fusion proteiner uttrycktes samtidigt i växtceller. Om protein A interagerar med protein B, kommer att då de två halvorna av luciferas beredas för att vara en aktiv luciferas enzym. Luciferas aktivitet kan upptäckas med en luminometer eller CCD-kamera. Det är inte nödvändigt att erhålla stabil transformants för LCI; övergående uttryck är tillräckligt för att få en hög kvalitet interaktion resultatet.
RING-typ E3 ubiquitin ligase konstituerande photomorphogenic 1 (COP1) samverkar med en myriad av transkriptionsfaktorer och främjar deras nedbrytning genom 26S proteasom11. Några av dessa COP1-riktade transkriptionsfaktorer är positiva regleringsmyndigheter för photomorphogenesis. I mörker interagerar COP1 med suppressor av phytochrome A-105 1 (SPA1), vilket förbättrar COP1 E3 aktivitet8. Efter föreställningen av ljus, kommer fotoreceptorer upphäva COP1-SPA1 interaktionen för att hämma COP1 aktivitet och sedan stabilisera COP1 substrat12,13,14. Detta exempel illustrerar den biologiska betydelsen av studera PPI och bestämma PPI dynamics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här är enkel och reproducerbara för att studera i vivo protein-protein interaktioner, och särskilt lämplig för att upptäcka protein interaktion dynamics under exogena behandling. Det viktigaste steget i denna analys är N. benthamiana infiltration. För att säkerställa infiltration framgång, måste växter vara mycket hälsosam. En annan kritisk faktor är när du ska kontrollera luciferas aktivitet efter infiltration. Det finns inget rätt svar för den här frågan. Fors…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av naturvetenskap Foundation i Jiangsuprovinsen (BK20140919), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31470375), prioritet akademiska Program utveckling av Jiangsu institutioner för högre utbildning och Qing Lan projekt.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
