Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых
Summary
Определение грибковых разнообразия в среде — это метод, используемых в профессиональных медицинских исследований для выявления опасностей для здоровья. Этот протокол описывает экстракции ДНК от профессиональных воздуха образцов для амплификации и последовательности грибковых ее регионов. Этот подход обнаруживает много грибковых видов, которые могут быть пропущены методами традиционной оценки.
Abstract
Традиционные методы выявления грибковых облучения профессиональных средах, таких как культуры и подходы на основе микроскопии, имеют некоторые ограничения, которые привели к исключению многих видов. Достижения в области за последние два десятилетия привели исследователей гигиены обратиться к молекулярной основанные подходы для выявления грибковых опасностей. Эти методы привели к выявлению многих видов в крытый и производственной среды, которые не были обнаружены с использованием традиционных методов. Этот протокол детали подход для определения грибковых разнообразия в воздухе образцы через геномной ДНК добычи, усилители, последовательности и таксономической идентификации грибковых внутренней трансляции распорку (СТС) регионах. ЕГО результаты секвенирования в обнаружении многих грибковых видов, которые не обнаружены или трудно определить на уровне видов, с использованием культуры или микроскопия. Хотя эти методы не обеспечивают количественные показатели грибковых бремени, они предлагают новый подход к идентификации опасностей и может использоваться для определения общей видовое богатство и разнообразие в профессиональной среде.
Introduction
Грибковые облучения в крытый и производственной средах может привести к респираторных заболеваний, включая аллергической сенсибилизации и астмы1. Определение опасностей, грибковых имеет важное значение для оценки рисков и предотвращение воздействия на работников. Эти грибковых опасности может быть результатом крытый заражения, проникновения наружного воздуха или экологические нарушения, которые приводят к перевозки грибковых материалов в районы, где работники являются настоящей2. Методы оценки воздействия грибковых включали выборки жизнеспособных культуры, а также микроскопические идентификация грибковых спор. Эти подходы имеют несколько ограничений и часто упускаем многие грибковых видов, которые могут способствовать общей грибковая бремя3. Подходы, основанные на культуру можно только дифференцировать эти жизнеспособных грибковых организмов, которые можно выращивать на питательных средах. Выявления грибковых спор до уровня видов через микроскопии могут быть confounded, споры, обмена аналогичными морфологии. Оба метода являются сильно зависит от микологи для анализа и выявления грибковых видов, с многих оставшихся неизвестными.
Для улучшения существующих методологий, используемых в профессиональных рисков идентификации и оценки воздействия, многие исследователи обратились к молекулярно-технологий. Подходы на основе виртуализации для оценки микробного разнообразия в крытый и профессиональной среде выявили широкий спектр плесневые столкнулись по сравнению с методами микроскопии и жизнеспособной культуры3,4 ,5. Метод, представленный здесь описывает отбор проб воздуха профессиональной среды и извлечение геномной ДНК для идентификации потенциальных опасностей грибковые. Идентификация опасности осуществляется путем виртуализации ядерной рибосомных внутренней трансляции распорка, или ее, регионы, которые сильно варьируется среди грибов и часто используются для различения плесневые6,7, 8,9. Многие виды найдены в профессиональной настройки, такие, как некоторые виды, принадлежащие к типу Базидиомицеты, не поддаются в жизнеспособные культуре и трудно дифференцировать микроскопически. Эти грибы были отмечены в высокое относительное изобилие в крытый и профессиональной среды, оценку последовательности грибковых ее регионы3,4,10. ЕГО виртуализации предоставляет больше знаний в разнообразие грибов, возникших в крытый и профессиональной среде.
Протокол описанные здесь методы, используемые для сбора, извлекать и усилить грибковых ее регионов от биоаэрозоли для анализа последовательностей детали. Этот подход использует Национальный институт профессиональной безопасности и здоровья (NIOSH) две ступени циклонов аэрозоля сборники для сбора твердых частиц в воздухе. Этот сборник был разработан для сбора биоаэрозоли и отдельный вдыхаемых (аэродинамический диаметр ≤4 мкм) и не вдыхаемых (> 4 мкм аэродинамический диаметр) частицы, которые позволяет для выявления грибковых организмов в пределах помещений, которые являются наиболее скорее всего быть вдыхании работника11. Другие пробоотборники воздуха, включая циклон пробоотборники, доступны на рынке, имеют возможность собирать частицы в вдыхаемых диапазоне (< 4 мкм) с помощью фильтров12,13. В противоположность этому сборники аэрозоля-двухступенчатый циклон NIOSH отделяет грибковых видов, основанный на их аэродинамический диаметр в одноразовые, полипропиленовые трубы, которые могут быть немедленно обработаны для нисходящие приложения14.
Процессы извлечения геномной ДНК и усиливая грибковых регионах ее подробно изложены в настоящем Протоколе. Извлечения представлены были разработаны методологии специально для извлечения геномной ДНК от грибков и бактерий, как многие коммерческие наборы целевой mammalian клеток, бактерии или специально дрожди15. Грунты, используемые в данном исследовании отбираются на основе их общий охват грибковых ее 1 и 2 ее регионов4,5. Последовательность этих регионов позволяет сравнивать многих накренился ее последовательностей, включая те, что последовательность ее 1 региона, ее 2 региона или в ее 1 и 2 ее регионах. Грибковые разнообразие проб воздуха, собранных в крытый настройки с помощью приведены эти методы, выявить значительное число последовательностей, типы, облеченных микологии и микологии, а также другие последовательности, принадлежащих к менее доминирующим грибковых типы, такие как Отдела зигомицетов. Широкое разнообразие грибковых последовательности, определенные с помощью этого подхода будет не захвачен с помощью методологии идентификации традиционные опасности как культивирование или микроскопии. Секвенирования грибковых ее регионов обеспечивает метод расширения для выявления грибковых опасностей и позволяет для лучшего понимания воздействия крытый и профессиональных грибковых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Определение грибковых разнообразия в профессиональной среде, используя подходы, основанные на последовательности улучшилась идентификации и воздействия оценки грибковых опасности. Используя этот подход позволил для выявления многих дополнительных грибковых видов, которые часто не…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали межведомственного соглашения между NIOSH и NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
