אוסף והפקת האוויר תעסוקתית דוגמאות לניתוח של DNA פטרייתי
Summary
קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה היא שיטה מנוצל בלימודי בריאות תעסוקתית לזהות את הסכנות הבריאותיות. פרוטוקול זה מתאר מיצוי DNA מדגימות האוויר תעסוקתית עבור הגברה ורצף של אזורים ITS פטרייתי. גישה זו מזהה הרבה מינים פטרייתי זה ניתן להתעלם על ידי שיטות הערכה מסורתית.
Abstract
שיטות מסורתיות של זיהוי חשיפות פטרייתי בסביבות תעסוקתית, כגון תרבות וגישות מבוסס מיקרוסקופיה, יש מספר מגבלות המביאים הדרה של מינים רבים. ההתקדמות בתחום בשני העשורים האחרונים הובילו בריאות תעסוקתית חוקרים לפנות מולקולרי המבוסס על גישות לזיהוי סיכונים פטרייתי. שיטות אלה גרמו הגילוי של מינים רבים בתוך סביבות מקורה בעיסוק זה לא זוהו בשיטות מסורתיות. זה פרטי פרוטוקול גישה לקביעת גיוון פטרייתי בתוך האוויר דוגמאות דרך הפקת דנ א גנומי, הגברה, רצף, זיהוי טקסונומי של פטריות פנימי עיבד אזורים מרווח (ITS). התוצאות שלה רצף זיהוי מינים רבים פטרייתי, כי הם לא זוהה או קשה לזהות לרמה מינים באמצעות תרבות או מיקרוסקופ. בעוד ששיטות אלה אינם מספקים מדדים כמותיים של הנטל פטרייתי, הם מציעים גישה חדשה זיהוי הזארד, יכול לשמש כדי לקבוע הכוללת מינים עושרה ורב -גוניותה בתוך סביבה תעסוקתית.
Introduction
חשיפות פטרייתי וסביבות מקורה בעיסוק יכול לגרום morbidities בדרכי הנשימה, כולל רגישות עולה אלרגיות, אסטמה1. זיהוי של מפגעים פטרייתי חשוב עבור הערכת הסיכון ומניעת חשיפה העובדים. מפגעים פטרייתי אלו עשויים להיות תוצאה של זיהום מקורה, חדירה חיצונית אוויר או הפרעה סביבתית, כי התוצאה הובלת חומרים פטרייתי לאזורים איפה העובדים הנוכחי2. שיטות להערכת חשיפה פטרייתי כללו דגימה תרבות בת קיימא, כמו גם זיהוי מיקרוסקופי של נבגי פטריות. גישות אלה יש מספר מגבלות ומשקיפים לעתים קרובות הרבה מינים פטרייתי זה יכול לתרום הנטל הכולל פטרייתי3. גישות התרבות מבדילים רק אלה יצורים פטרייתי קיימא זה יכול להיות מעובד במדיה מזין. זיהוי נבגי פטריות מיני לרמה באמצעות מיקרוסקופ יכול להיות מבולבל על ידי נבגים שיתוף מורפולוגיות דומות. שתי השיטות הן תלויות במידה רבה mycologists לנתח ולזהות המין פטרייתי, עם רבים שנותרו לא מזוהה.
כדי לשפר את מתודולוגיות הקיימים בשימוש זיהוי סיכון מקצועי והערכות לחשיפה, חוקרים רבים הפכו לטכנולוגיות מבוססות-מולקולרית. גישות רצף להערכת גיוון חיידקים בתוך סביבות מקורה בעיסוק חשפו ספקטרום רחב יותר של מינים פטרייתי נתקל לעומת שיטות כמו מיקרוסקופ תרבות בת קיימא3,4 ,5. השיטה המוצגת כאן מתאר את הדגימה האוויר של סביבות תעסוקתית, הפקת דנ א גנומי לצורך זיהוי סכנות פוטנציאליות פטרייתי. זיהוי סיכון מושגת על ידי רצף של גרעיני ribosomal מרווח משועתקים פנימי או ITS, אזורים משתנה מאוד בין פטריות, שימשו בדרך כלל כדי להבדיל בין המינים פטרייתי6,7, 8,9. מינים רבים למצוא במסגרות תעסוקתיות, כמו מינים מסוימים השייכים שלקרוא פטריות בסיסה, לא ניתנים לזיהוי בתרבות קיימא, שקשה להבדיל ברמה המיקרוסקופית. פטריות אלה נצפו בשפע היחסי גבוה בתוך סביבות מקורה בעיסוק מוערך על ידי רצף פטרייתי ITS אזורים3,4,10. רצף שלו סיפק ידע רב יותר לתוך המגוון של פטריות נתקל בתוך סביבות מקורה בעיסוק.
הפרוטוקול המתוארים כאן פרטים השיטות נהגו לאסוף לחלץ, להגביר את האזורים ITS פטרייתי מ bioaerosols לניתוח רצף. גישה זו מנצל את המכון הלאומי לבריאות (NIOSH) ובטיחות תעסוקתית ציקלון בשני שלבים תרסיס סמפלר לאסוף את החלקיקים באוויר. סמפלר זו פותחה כדי לאסוף את bioaerosols נפרדת respirable (≤4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) ו- respirable (> 4 מיקרומטר אווירודינמי קוטר) חלקיקים, המאפשר זיהוי של אורגניזמים פטרייתי בתוך סביבות מקורה ביותר נוטים להיות בשאיפה של העובד11. דוגמי אוויר אחרים, לרבות ציקלון סמפלרים, הינם זמינים על שוק זה יש את היכולת לאסוף את החלקיקים בתוך הטווח respirable (< 4 מיקרומטר) באמצעות מסננים12,13. לעומת זאת, הדוגם תרסיס בשני שלבים ציקלון NIOSH מפריד מינים פטרייתי מבוסס על קוטר אווירודינמי שלהם לתוך צינורות פוליפרופילן, חד פעמיים אשר ניתן לעבד באופן מיידי עבור יישומי הזרם14.
התהליכים של חילוץ דנ א גנומי ותגביר את האזורים ITS פטרייתי מפורטים של פרוטוקול זה. למתודולוגיות החילוץ הציג פותחו במיוחד עבור הפקת דנ א גנומי פטריות וחיידקים, כמו הרבה ערכות מסחרי למטרה בתרבית של תאים, חיידקים או שמרים במיוחד15. צבעי יסוד השתמשו במחקר זה נבחרו בהתבסס על הכיסוי שלהם הכוללת של פטריות 1 שלה והן שלה 2 אזורים4,5. רצף של אזורים אלה מאפשר השוואת הרבה רצפים ITS הפקידה, כולל אלה הרצף האזור 1 שלה, שלה 2 אזור או אזורים 1 שלה והן 2 שלה. המגוון פטרייתי של האוויר דוגמאות שנאספו הגדרה מקורה באמצעות שיטות אלה מוצגים, חשיפת מספר ניכר של רצפי להציב את phyla פטריות שק ו פטריות בסיסה, כמו גם רצפים אחרים השייכים phyla פטרייתי פחות דומיננטי, כגון זוגניות. המגוון הרחב של רצפי פטרייתי מזוהה באמצעות גישה זו לא יילכדו באמצעות מתודולוגיות זיהוי סיכון מסורתיים כמו טיפוח או מיקרוסקופ. רצף של אזורים ITS פטרייתי מספק שיטה משופרת כדי לזהות מפגעים פטרייתי וגם מאפשרים הבנה טובה יותר של חשיפות תעסוקתיות ומקורה פטרייתי.
Protocol
Representative Results
Discussion
קביעת המגוון פטרייתי בתוך סביבה תעסוקתית באמצעות גישות רצף השתפרה הערכת סיכון פטרייתי זיהוי וחשיפה. באמצעות גישה זו אפשרה איתור מינים פטרייתי נוספים רבים אשר לעיתים קרובות לא מזוהים באמצעות תרבות או מבוסס מיקרוסקופיה שיטות ההערכה. שיטת דגימה bioaerosols סביבות תעסוקתית, מקורה, הפקת דנ א גנומי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הסכם הסוכנויות בין NIOSH NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
