Collecte et Extraction des échantillons d’Air professionnel pour l’analyse de l’ADN fongique
Summary
Détermination de la diversité fongique au sein d’un environnement est une méthode utilisée dans les études de santé au travail afin d’identifier les risques pour la santé. Ce protocole décrit l’extraction d’ADN provenant d’échantillons d’air professionnel pour l’amplification et le séquençage des régions ITS fongiques. Cette approche détecte plusieurs espèces fongiques qui peuvent être négligées par les méthodes d’évaluation traditionnelles.
Abstract
Les méthodes traditionnelles d’identification fongiques expositions dans des environnements professionnels, comme la culture et les approches axées sur la microscopie, présentent plusieurs limites qui ont conduit à l’exclusion de nombreuses espèces. Avancées dans le domaine au cours des deux dernières décennies ont conduit les chercheurs en santé au travail à se tourner vers des approches moléculaires pour l’identification des risques fongiques. Ces méthodes ont permis de détecter de nombreuses espèces dans des environnements intérieurs et professionnels qui n’ont pas été détectés à l’aide de méthodes traditionnelles. Ce Détails du protocole une approche permettant de déterminer la diversité fongique dans l’air des échantillons par l’extraction d’ADN génomique, d’amplification, séquençage et identification taxonomique des fongiques interne transcrits régions intergéniques (ITS). SES résultats de séquençage dans la détection de nombreuses espèces de champignons qui ne sont pas détectés ou difficilement identifiables au niveau de l’espèce à l’aide de la culture ou la microscopie. Alors que ces méthodes ne fournissent pas de mesures quantitatives du fardeau fongique, ils offrent une nouvelle approche pour l’identification des dangers et peuvent être utilisées pour déterminer la richesse globale en espèces et la diversité au sein d’un milieu de travail.
Introduction
Exposition fongique dans les environnements d’intérieurs et au travail peut entraîner des morbidités respiratoires, y compris la sensibilisation allergique et l’asthme1. Identification des dangers fongiques est importante pour évaluer le risque et prévenir l’exposition des travailleurs. Ces risques fongiques peuvent être le résultat d’une contamination intérieure, intrusion d’air extérieur ou perturbations environnementales qui entraînent le transport des matières fongiques dans des zones où les travailleurs sont présents2. Méthodes pour évaluer l’exposition fongique ont inclus la culture viable échantillonnage ainsi que l’identification microscopique des spores fongiques. Ces approches présentent plusieurs limites et oublient souvent de nombreuses espèces de champignons qui pourraient contribuer au fardeau global fongiques3. Approches axées sur la culture peuvent différencier uniquement ces organismes fongiques viables qui peuvent être cultivées sur des milieux nutritifs. Identifier les spores fongiques au niveau de l’espèce par l’intermédiaire de la microscopie peut être confondu par des spores partage morphologies similaires. Les deux méthodes sont fortement tributaires des mycologues pour analyser et identifier les espèces de champignons, avec nombreux restent non identifiés.
Pour améliorer les méthodologies existantes utilisées dans l’identification des risques professionnels et les évaluations de l’exposition, de nombreux chercheurs se sont tournés vers technologies moléculaires. Approches axées sur les séquençage permettant d’évaluer la diversité microbienne dans les environnements intérieurs et professionnels ont mis en évidence un plus large éventail d’espèces de champignons rencontrés par rapport à des méthodes telles que la microscopie et la culture viable3,4 ,,5. La méthode présentée ici décrit l’échantillonnage de l’air des milieux professionnels et l’extraction d’ADN génomique pour l’identification des dangers potentiels de champignons. Identification des dangers est accomplie en séquençant le nucléaire ribosomique espaceur interne transcrit, ou STI, régions qui sont très variables chez les champignons et ont été utilisées pour différencier les espèces fongiques6,7, 8,9. Beaucoup d’espèces trouvés dans des environnements professionnels, tels que certaines espèces appartenant au phylum Basidiomycota, ne sont pas identifiables dans la culture viable et est difficiles à différencier au microscope. Ces champignons ont été observés en grande abondance dans les environnements intérieurs et professionnels évalués par séquençage fongiques ITS régions3,4,10. SON séquençage a fourni une plus grande connaissance de la diversité des champignons rencontrés dans les environnements intérieurs et au travail.
Le protocole décrit ici les méthodes utilisées pour recueillir, extraire et amplifier des régions ITS fongiques de bioaérosols pour l’analyse des séquences de détails. Cette approche utilise le National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) échantillonneur d’aérosol biétage cyclone recueillir des particules en suspension dans l’air. Cet échantillonneur a été développé afin de recueillir les bioaérosols et séparé respirable (≤ 4 µm de diamètre aérodynamique) et non respirables (> 4 µm de diamètre aérodynamique) particules, ce qui permet l’identification des organismes fongiques au sein d’environnements intérieurs qui sont les plus susceptibles d’être inhalées par un travailleur11. Autres échantillonneurs d’air, y compris les échantillonneurs de cyclone, sont disponibles sur le marché qui ont la capacité de recueillir des particules dans la gamme respirable (< 4 µm) à l’aide de filtres12,13. En revanche, l’échantillonneur aérosol NIOSH biétage cyclone sépare issus de leur diamètre aérodynamique dans des tubes jetables, en polypropylène qui peuvent être transformés immédiatement pour applications en aval de14espèces de champignons.
Les processus d’extraction d’ADN génomique et d’amplifier des régions ITS fongiques sont détaillées dans le présent protocole. Les méthodes d’extraction présentées ont été développés spécifiquement pour l’extraction de l’ADN génomique des champignons et des bactéries, comme beaucoup de kits commerciaux ciblent des cellules de mammifères, bactéries ou spécifiquement levures15. Les amorces utilisées dans cette étude sont choisis sur leur couverture globale des fongiques ITS 1 et 2 de ses régions4,5. Le séquençage de ces régions permet la comparaison des nombreuses séquences ITS en banque, y compris ceux cette séquence la région ITS 1, ITS 2 région ou des régions ITS 1 tant ses 2. La diversité fongique des échantillons d’air prélevés dans un réglage intérieur à l’aide de que ces méthodes sont indiquées, révélant un grand nombre de séquences placés dans le phyla ascomycètes et basidiomycètes, mais aussi les autres séquences appartenant aux moins dominant phyla fongique, tels que Zygomycota. La grande diversité des champignons séquences identifiées à l’aide de cette approche ne serait pas être capturée à l’aide de méthodologies d’identification risque traditionnels comme la culture ou la microscopie. Le séquençage des régions ITS fongiques fournit une méthode améliorée pour identifier les risques fongiques et permettre une meilleure compréhension de l’exposition fongique intérieure et au travail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Détermination de la diversité fongique au sein d’un milieu de travail à l’aide d’approches axées sur le séquençage a amélioré évaluation identification et exposition des risques fongiques. En utilisant cette approche a permis la détection de nombreuses autres espèces fongiques qui sont souvent non détectés à l’aide de la culture ou les méthodes d’évaluation axée sur la microscopie. Une méthode d’échantillonnage bioérosols des environnements professionnels et intérieures et l’extraction …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par un accord interinstitutions entre NIOSH et NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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