Erfassung und Gewinnung von betrieblichen Luftproben für Analyse der Pilz DNA
Summary
Bestimmung der Pilzen Vielfalt innerhalb einer Umgebung ist eine Methode, bei der arbeitsmedizinischen Untersuchungen, gesundheitliche Gefahren zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt DNA-Extraktion aus beruflichen Luftproben Amplifikation und Sequenzierung der Pilz ITS Regionen. Dieser Ansatz erkennt viele Pilzarten, die von traditionellen Bewertungsmethoden übersehen werden können.
Abstract
Traditionelle Methoden zur Identifizierung von Pilz Expositionen am Arbeitsplatz-Umgebungen, wie Kultur und Mikroskopie-basierte Ansätze, haben einige Einschränkungen, die den Ausschluss vieler Arten geführt haben. Fortschritte auf dem Gebiet in den letzten zwei Jahrzehnten haben Arbeitssicherheit Forscher zu molekularen basierende Ansätze zur Identifizierung von Pilz Gefahren geführt. Diese Methoden haben zur Erkennung vieler Arten innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung geführt, die mit traditionellen Methoden nicht erkannt wurden. Dieser Ansatz zur Bestimmung der Pilz Vielfalt innerhalb der Luft durch genomische DNA-Extraktion, Amplifikation und Sequenzierung taxonomische Identifizierung der Pilz interne Proben Protokolldetails transkribiert Abstandhalter (ITS) Regionen. DIE Sequenzierung Ergebnisse bei der Erkennung von viele Pilzarten, die entweder nicht erkannt oder schwierig, auf Artniveau mit Kultur oder Mikroskopie zu identifizieren sind. Während diese Methoden keine quantitative Maßnahmen der Pilz Belastung angeben, sie bieten einen neuen Ansatz zur Ermittlung schädlicher Wirkungen und können verwendet werden, um allgemeine Artenreichtum und Vielfalt im beruflichen Umfeld bestimmen.
Introduction
Pilze Belichtungen in innen- und beruflichen Umgebungen können Atemwege Begleiterkrankungen, einschließlich allergische Sensibilisierung und Asthma1führen. Pilz Gefahren ist wichtig für die Bewertung des Risikos und Exposition der Arbeitnehmer zu verhindern. Dieser Pilzen Gefahren möglicherweise ein Ergebnis von indoor Kontamination, Außenluft eindringen oder Störeinflüsse, die bei der Beförderung von Pilz Materialien in Bereiche führen, wo Arbeitnehmer derzeit2. Methoden zur Beurteilung Pilz Exposition haben tragfähige Kultur Probenahme sowie mikroskopische Bestimmung von Pilzsporen enthalten. Diese Ansätze haben mehrere Einschränkungen und oft übersehen viele Pilzarten, die insgesamt Pilz Last3beitragen könnte. Kultur-basierte Ansätze können nur jene tragfähigen pilzorganismen unterscheiden, die auf Nährmedien kultiviert werden kann. Identifizierung von Pilzsporen auf Artniveau über Mikroskopie kann durch Sporen teilen ähnliche Morphologien verwechselt werden. Beide Methoden sind stark abhängig von Mykologen zu analysieren und identifizieren die Pilzarten mit vielen verbleibenden unbekannten.
Um vorhandene Methodiken Berufsrisiko Identifikation und Expositionsabschätzungen zu verbessern, haben viele Forscher Molekulare basierenden Technologien geworden. Sequenzierung-basierte Ansätze für die Bewertung der mikrobiellen Diversität innerhalb der innen- und beruflichen Umgebung ergaben ein breiteres Spektrum an Pilzarten begegnet verglichen mit Methoden wie Mikroskopie und tragfähige Kultur3,4 ,5. Die hier vorgestellte Methode beschreibt die Luftproben der beruflichen Umgebungen und Extraktion von genomischer DNA für die Identifizierung der möglichen Pilzbefall Gefahren. Ermittlung schädlicher Wirkungen geschieht durch Sequenzierung der nuklearen ribosomale interne transkribierten Abstandhalter oder ITS, Regionen, die sehr variabel zwischen Pilzen und wurden häufig verwendet, um Pilzarten6,7zu unterscheiden, 8,9. Viele Arten gefunden in beruflichen Einstellungen, wie z. B. einige Arten gehören zu den Phylum Basidiomycota, sind nicht erkennbar in tragfähige Kultur und sind schwer zu mikroskopisch unterscheiden. Diese Pilze sind in hohe relative Häufigkeit in innen- und beruflichen Umgebungen durch Sequenzierung Pilz ITS Regionen3,4,10bewertet beobachtet worden. DIE Sequenzierung hat mehr wissen in die Vielfalt der Pilze begegnet in innen- und am Arbeitsplatz-Umgebungen zur Verfügung gestellt.
Das Protokoll beschriebenen hier Einzelheiten der Methoden zu sammeln, zu extrahieren und Pilze ITS Regionen von bioaerosolen für Sequenzanalyse zu verstärken. Dieser Ansatz nutzt das National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) zweistufige Zyklon-Aerosol-Sampler, Partikel in der Luft zu sammeln. Dieses Tuch wurde entwickelt, um Bioaerosole und Separate lungengängigen (≤4 µm aerodynamischen Durchmesser) zu sammeln und nicht-Lungengängige (> 4 µm aerodynamischen Durchmesser) Teilchen, die zur Identifizierung der pilzorganismen innerhalb von geschlossenen Räumen ermöglicht, die meisten sind voraussichtlich um Arbeiter11eingeatmet werden. Andere Luft-Sampler, einschließlich Zyklon Sampler gibt es auf dem Markt, die die Fähigkeit haben, im Bereich atembarer Partikel sammeln (< 4 µm) mit12,13filtert. Im Gegensatz dazu trennt der NIOSH zweistufigen Zyklon Aerosol Sampler Pilzarten anhand ihrer aerodynamischen Durchmesser in Einweg, Polypropylen-Rohre, die sofort für downstream-Anwendungen14verarbeitet werden können.
Die Prozesse der genomischen DNA Extraktion und verstärken die Pilzen ITS-Regionen sind in diesem Protokoll aufgeführt. Die Extraktion Methoden vorgestellt wurden speziell für die Extraktion von genomischer DNA aus Pilzen und Bakterien, wie viele kommerzielle Kits Säugetier-Zellen, Bakterien oder speziell Hefen15Ziel entwickelt. Die in dieser Studie verwendeten Primer werden anhand ihrer insgesamt Abdeckung der Pilz seine 1 und ITS 2 Regionen4,5ausgewählt. Sequenzierung dieser Regionen kann für den Vergleich vieler Querneigung ITS-Sequenzen, einschließlich derjenigen dieser Sequenz der ITS-1-Region, ITS-2-Region oder der ITS 1 und ITS 2 Regionen. Die Pilze Vielfalt von Luftproben gesammelt in einer indoor-Einstellung mit, die diese Methoden gezeigt werden, enthüllt eine beträchtliche Anzahl von Sequenzen in die Stämme gelegt, Schlauchpilze und Basidiomycota sowie andere Sequenzen Zugehörigkeit zu weniger dominant Pilz Stämme, wie Zygomycota. Die breite Vielfalt der Pilz Sequenzen identifiziert mit diesem Ansatz würde nicht mit traditionellen Gefahr Kennzeichnung Methoden wie Anbau oder Mikroskopie erfasst werden. Sequenzierung der Pilz ITS Regionen bietet eine verbesserte Methode um Pilz Gefährdungen ermitteln und ermöglichen ein besseres Verständnis der innen- und berufliche Pilz Belichtungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bestimmung der Pilzen Vielfalt im beruflichen Umfeld durch Sequenzierung-basierte Ansätze hat Pilz Gefährdungsabschätzung Identifikation und Belichtung verbessert. Mit diesem Ansatz hat für den Nachweis von vielen zusätzlichen Pilzarten, die oft nicht erkannt werden mit Kultur oder Mikroskopie-basierte Methoden der Bewertung erlaubt. Ein Verfahren für die Probenahme von bioaerosolen aus beruflichen und indoor-Umgebungen und die Extraktion von genomischer DNA aus Luftproben für seine Amplifikation und Sequenzierung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen NIOSH und NIEHS (AES12007001-1-0-6) unterstützt.
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
