Toplama ve mesleki hava örnekleri çıkarma mantar DNA analizi için
Summary
Bir ortam içerisinde mantar çeşitlilik belirleme iş sağlığı çalışmalarda sağlık tehlikeleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı DNA çekme–dan amplifikasyon ve sıralamanın mantar Its bölgeler için mesleki hava örnekleri açıklar. Bu yaklaşım geleneksel değerlendirme yöntemleri tarafından göz ardı edilebilir birçok mantar türleri algılar.
Abstract
Kültür ve mikroskopi tabanlı yaklaşımlar gibi mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler tanımlama geleneksel yöntemleri birçok türü dışlanması sonuçlandı çeşitli kısıtlamalar bulunmaktadır. Son yirmi yılda alanındaki gelişmeler iş sağlığı araştırmacılar mantar tehlikeleri tanımlamak için moleküler tabanlı yaklaşımlara açmak için açmıştır. Bu yöntemler geleneksel yöntemlerle tespit değil kapalı ve mesleki ortamlarda birçok türün algılama sonuçlandı. Genomik DNA ekstraksiyon, güçlendirme, sıralama ve taksonomik tanımlaması mantar iç hava içinde mantar çeşitlilik belirlemek için bir yaklaşım örnekleri bu protocol detayları Rondela (ITS) bölgeleri transkripsiyonu. Sıralama sonuçları algılanan veya kültür veya mikroskobu kullanarak tür seviyeye tespit etmek zordur birçok mantar türünün bulunması. Bu yöntemler mantar yükünün nicel ölçüleri sağlamak değil, onlar tehlike tanımlama için yeni bir yaklaşım sunuyoruz ve Genel türler zenginliği ve çeşitlilik mesleki bir ortam içerisinde belirlemek için kullanılan.
Introduction
Kapalı ve mesleki ortamlarda mantar Etkilenmeler Alerjik Sensitizasyonu ve astım1gibi solunum morbiditeler içinde sonuçlanabilir. Mantar tehlikeleri tanımlaması risk değerlendirilmesi ve işçi pozlama önlenmesi için önemlidir. Bu mantar tehlikeler kapalı kirlenme, açık hava saldırı veya mantar malzemeleri nakliyesi işçilerin mevcut2nerede alanlara neden çevre bozuklukları sonucu olabilir. Mantar değerlendirmek için yöntemler mikroskobik mantar sporları tanımlaması yanı sıra uygun kültür örnekleme dahil ettik. Bu yaklaşımlar çeşitli sınırlama vardır ve sık sık gözden kaçırmak için genel olarak mantar yük3katkıda birçok mantar türü. Kültür tabanlı yaklaşımlar sadece besin medyada ekili uygun bu mantar organizmalar ayırt edebilir. Mantar sporları türler düzeye mikroskobu ile tanımlayan benzer türleri Morfoloji paylaşımı sporlar tarafından şaşırmış. Her iki yöntem son derece analiz ve birçok kalan tanımlanamayan mantar türleri, belirlemek için mycologists bağlı.
Mesleki tehlike tanımlama ve pozlama Değerlendirmeler kullanılan mevcut metodolojiler üzerine geliştirmek için pek çok araştırmacı moleküler tabanlı teknolojileri kapatmış. Mikrobiyal çeşitlilik kapalı ve mesleki ortamlarda değerlendirmek için yaklaşımlar dayandırılmış mikroskobu ve uygun kültür3,4 gibi yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha geniş bir spektrum karşılaştı mantar türlerinin ortaya koymuştur ,5. Burada sunulan yöntem iş ortamları hava örnekleme ve potansiyel mantar tehlikeleri tanımlanması için genomik DNA ekstraksiyon açıklar. Tehlike tanımlama nükleer ribozomal iç kopya etmek rondela veya Its, mantarlar arasında değişkendir ve sık mantar türleri6,7ayırt etmek için kullanılmış olan bölgelerin sıralama tarafından gerçekleştirilir, 8,9. Birçok canlı türünün uygun kültür olarak tanımlanabilir Bazidyumlu mantarlar, türe ait bazı türler değildir gibi mesleki ayarlarında buldum ve mikroskobik ayırt etmek zordur. Bu mantarlar sıralama mantar Its bölgeleri3,4,10tarafından değerlendirildi kapalı ve mesleki ortamlarda yüksek göreli bolca gözlenmiştir. KENDİ sıralama içine kapalı ve mesleki ortamlar içinde karşılaşılan mantarlar çeşitliliği daha fazla bilgi sağlamıştır.
Protokol yöntemleri toplamak, hulâsa ve bioaerosols dizi analizi için mantar Its bölgelerden yükseltmek için kullanılan ayrıntılarını tanımlamak burada. Bu yaklaşım hava parçacıkları toplamak mesleki güvenlik ve Sağlık (NIOSH) iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici Ulusal Enstitüsü kullanır. Bu örneği bioaerosols ve ayrı solunabilir (≤4 µm aerodinamik çapı) toplamak için geliştirilmiştir ve solunabilir sigara (> 4 µm aerodinamik çapı) çoğu kapalı ortamlarda mantar organizmalar tanımlanması için sağlar parçacıklar işçi11tarafından inhale muhtemeldir. Siklon numune, dahil olmak üzere diğer hava numune parçacıklar solunabilir Aralık içinde toplamak için yeteneği var piyasada bulunan (< 4 µm) kullanarak filtre12,13. Buna ek olarak, NIOSH iki aşamalı Siklon sprey örnekleyici mantar türleri içine aşağı akım uygulamaları14için hemen işlenebilir tek kullanımlık, polipropilen borular üzerinde aerodinamik kendi çapı göre ayırır.
Genomik DNA ayıklanması ve mantar Its bölgeleri yükseltecek işlemlere bu protokol için ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Memeli hücre, bakteri veya özellikle Mayalar15birçok ticari kitleri hedef olarak sunulan çıkarma yöntemleri mantar ve bakteri, genomik DNA’ın çıkarılması için özel olarak geliştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan astar mantar onun 1 ve onun 2 bölgeleri4,5genel onların kapsama göre seçilir. Bu bölgelerin sıralama çok banked ITS dizileri de dahil olmak üzere, karşılaştırma için o dizi onun 1 bölge, onun 2 bölge veya onun 1 ve onun 2 bölgeleri sağlar. Hava örnekleri mantar çeşitliliği bir kapalı ayarı bu yöntemleri gösterilir, Ascomycota ve Bazidyumlu mantarlar kültürlenebilen yerleştirilen dizileri yanı sıra diğer serileri gibi daha az baskın mantar kültürlenebilen için ait önemli sayıda açığa kullanarak toplanan Zygomycota. Bu yaklaşımı kullanarak tanımlanan mantar sıralarının geniş çeşitlilik ekimi veya mikroskobu gibi geleneksel tehlike tanımlama yöntemlerini kullanarak esir edilemeyen değil. Mantar Its bölgelerin sıralama mantar tehlikeleri tanımlamak ve daha iyi kapalı ve mesleki mantar pozlama anlamak için izin vermek için gelişmiş bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dayandırılmış yaklaşımlar kullanarak bir iş ortamı içinde mantar çeşitlilik belirleme mantar tehlike tanımlama ve pozlama değerlendirme geliştirdi. Bu yaklaşımı kullanarak kültür veya değerlendirme mikroskobu tabanlı yöntemleri kullanarak algılanır çoğu zaman birçok ek mantar türü algılama için izin verdi. Bioaerosols mesleki ve kapalı ortamları ve genomik DNA çekme–dan onun amplifikasyon ve sıralama için hava örnekleri örnekleme yöntemi burada sunulmaktadır. Tespitler mantar çe?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen NIOSH ve NIEHS (AES12007001-1-0-6) arasında bir kurumlararası anlaşma tarafından desteklenmiştir.
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
