Collectie en extractie van beroepsmatige Air monsters voor analyse van schimmel DNA

Summary

Het bepalen van de schimmel diversiteit binnen een omgeving is een methode gebruikt in studies van de gezondheid op het werk te identificeren van de gevaren voor de gezondheid. Dit protocol beschrijft DNA-extractie uit beroepsmatige lucht monsters voor de versterking en de sequencing van schimmel ITS-regio’s. Deze aanpak detecteert vele schimmel soorten die kunnen worden overzien door traditionele beoordelingsmethoden.

Abstract

Traditionele methoden voor het identificeren van schimmel posities in professionele omgevingen, zoals cultuur en microscopie gebaseerde benaderingen, hebben verscheidene beperkingen die hebben geleid tot de uitsluiting van vele soorten. Ontwikkelingen op het gebied in de afgelopen twee decennia hebben onderzoekers van de gezondheid op het werk te wenden tot moleculaire gebaseerde benaderingen voor de identificatie van de gevaren van de schimmel geleid. Deze methoden hebben geleid tot de detectie van vele soorten in binnen- en werk-omgevingen die niet zijn gevonden met behulp van traditionele methoden. De gegevens van dit protocol een aanpak voor het bepalen van de schimmel diversiteit binnen lucht monsters door genomic DNA-extractie, versterking, sequencing en taxonomische identificatie van schimmel interne getranscribeerd spacer (ITS) regio’s. DE rangschikking resulteert in de opsporing van vele schimmel soorten die zijn ofwel niet gedetecteerd of moeilijk vast te stellen op niveau van de soorten met cultuur of microscopie. Terwijl deze methoden geen kwantitatieve metingen van schimmel last bieden, ze bieden een nieuwe benadering van de gevaren en kunnen worden gebruikt voor het bepalen van de algemene soortenrijkdom en diversiteit in een professionele omgeving.

Introduction

Schimmel posities in binnen- en beroepsmatige omgeving kunnen leiden tot respiratoire morbiditeit, met inbegrip van allergische sensibilisatie en astma¹. Identificatie van de gevaren van de schimmel is belangrijk voor de beoordeling van risico’s en het voorkomen van blootstelling van de werknemer. Deze schimmel gevaren kunnen een gevolg zijn van binnen besmetting, buitenlucht inbraak of verstoringen van het milieu die resulteren in het vervoer van schimmel materialen in gebieden waar werknemers aanwezig². Methoden voor het beoordelen van de schimmel blootstelling hebben opgenomen levensvatbare cultuur bemonstering, alsmede de microscopische identificatie van schimmelsporen. Deze benaderingen hebben verschillende beperkingen en vaak over het hoofd veel schimmel soorten die aan de algehele schimmel last^{3 bijdragen kunnen}. Cultuur gebaseerde benaderingen kunnen alleen die levensvatbare schimmel organismen die kunnen worden geteeld op voedingsbodems differentiëren. Identificeren van schimmelsporen naar soorten niveau via microscopie kan worden verward door sporen delen van soortgelijke morphologies. Beide methoden zijn sterk afhankelijk van mycologen te analyseren en identificeren van de schimmel soort, met veel resterende niet-geïdentificeerde.

Om te verbeteren op bestaande methodes gebruikt in occupational hazard identificatie en beoordeling van de blootstelling, hebben vele onderzoekers aan moleculaire gebaseerde technologieën gedraaid. Sequencing gebaseerde benaderingen voor de beoordeling van de microbiële diversiteit in binnen- en beroepsmatige omgeving is gebleken dat een breder spectrum van schimmel soorten ondervonden vergeleken met methoden zoals microscopie en levensvatbare cultuur^{3,4 ,5}. De hier gepresenteerde methode beschrijft de lucht bemonstering van beroepsmatige omgevingen en extractie van genomic DNA voor de identificatie van de potentiële gevaren van de schimmel. Identificatie van de gevaren gebeurt door de rangschikking van de nuclear ribosomal interne getranscribeerde spacer of ITS, regio’s die onder de schimmels zeer variabel zijn en zijn gewoonlijk gebruikt om schimmel soorten^{6,7, differentiëren 8,9}. Vele soorten gevonden in professionele instellingen, zoals sommige soorten die behoren tot de stam Basidiomycota, zijn niet identificeerbare in levensvatbare cultuur en zijn moeilijk te onderscheiden microscopisch. Deze schimmels zijn waargenomen in hoge relatieve overvloed in binnen- en beroepsmatige omgeving beoordeeld door sequentiebepaling schimmel ITS regio’s^3,4,10. DE volgorde heeft meer kennis verschaft in de diversiteit van de schimmels ondervonden in binnen- en beroepsmatige omgeving.

Het protocol beschreven hier details de methoden gebruikt voor het verzamelen, uitpakken en versterken van schimmel ITS-regio’s uit bioaerosols voor sequentieanalyse. Deze aanpak maakt gebruik van het National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) tweetraps cycloon aërosol sampler voor het verzamelen van deeltjes in de lucht. Deze sampler werd ontwikkeld voor het verzamelen van bioaerosols en separaat inadembare (≤4 µm aërodynamische diameter) en niet-respirabel (> 4 µm aërodynamische diameter) deeltjes, die het mogelijk maakt voor de identificatie van schimmel organismen in overdekte omgevingen die het meest waarschijnlijk door een werknemer¹¹worden ingeademd. Andere lucht samplers, met inbegrip van cycloon samplers, zijn beschikbaar op de markt die hebben de mogelijkheid om het verzamelen van deeltjes binnen het inadembare bereik (< 4 µm)^12,13met behulp van filters. In tegenstelling, scheidt de NIOSH tweetraps cycloon aërosol sampler schimmel soorten op basis van hun aërodynamische diameter in wegwerp, polypropyleen-buizen die onmiddellijk kunnen worden verwerkt voor downstream toepassingen¹⁴.

Het proces van extractie van genomic DNA en versterken van de schimmel ITS regio’s worden beschreven in dit protocol. De methoden van de extractie gepresenteerd hebben speciaal ontwikkeld voor de extractie van genomic DNA van schimmels en bacteriën, zoals veel commerciële kits cellen van zoogdieren, bacteriën, of specifiek gisten^{15 target}. De inleidingen gebruikt in deze studie zijn geselecteerd op basis van hun totale dekking van zowel de schimmel ITS 1en ITS 2 regio’s^4,5. Rangschikken van deze regio’s zorgt voor de vergelijking van vele dwarshelling ITS sequenties, met inbegrip van degenen die volgorde het ITS 1-gebied, het zijn 2 regio of ITS 1 zowel de ITS 2 regio’s. De schimmel diversiteit van lucht monsters verzameld in een overdekt instellen met behulp van die deze methoden worden getoond, onthulling van een aanzienlijk aantal sequenties geplaatst in de stammen ascomyceten en Basidiomycota evenals andere sequenties die behoren tot de minder dominante schimmel stammen, zoals Zygomycota. De brede diversiteit van schimmel sequenties geïdentificeerd met behulp van deze aanpak zou niet worden gevangen met behulp van traditionele gevaar identificatie methodologieën zoals teelt of microscopie. Sequentiebepaling van schimmel ITS regio’s biedt een verbeterde methode om te identificeren schimmel gevaren en zorgen voor een beter begrip van binnen- en beroepsmatige schimmel posities.

Protocol

1. voorbereiding van de NIOSH aërosol sampler Opmerking: De NIOSH aërosol sampler is een twee-traps cycloon aërosol sampler die verzamelt bioaerosols met behulp van twee bemonstering buizen en een polytetrafluorethyleen (PTFE) filter. Vóór de vergadering, zorgvuldig inspecteren de sampler. Controleer de sampler om ervoor te zorgen het niet beschadigd is, alle schroeven zijn in plaats en snug en de afdichtende tape rond de naad gevormd door de twee helften is intact. Inspecteer d…

Representative Results

De verdeling van de soorten binnen een omgeving kan worden beoordeeld met behulp van relatieve overvloed door bepaling van het aantal klonen van elke OTU geïdentificeerd in de monsters van de lucht. Figuur 6 is een grafiek van de kroon van het taxonomisch geplaatste soorten binnen een binnenmilieu na 60 min van de bemonstering van de lucht. Het kan worden waargenomen dat het milieu bevat een verscheidenheid van soorten binnen twee grote schimmel stammen, asc…

Discussion

Bepaling van de schimmel diversiteit binnen een professionele omgeving met behulp van sequencing gebaseerde benaderingen verbeterd beoordeling over de identificatie en de blootstelling van de schimmel gevaren. Met behulp van deze benadering is toegestaan voor de detectie van vele extra schimmel soorten die vaak niet worden gedetecteerd met behulp van cultuur of microscopie gebaseerde methoden voor de beoordeling. Een methode voor de bemonstering van de bioaerosols van beroeps- en indoor omgevingen en de extractie van gen…

Materials

NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler	NIOSH	BC251	The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps	Fisher Scientific	02-681-373	1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096	15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width	McMaster-Carr	76505A1	sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm	SKC Inc.	225-3LF	3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm	EMD Millipore	FSLW03700	Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps	Fisher Scientific	09-753-50	filter forceps
Model 502 Precision PanaPress	PanaVise	502	pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large	SKC Inc.	225-112	calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump	SKC Inc.	224-PCXR4	sampling pump
Mass Flowmeter 4140	TSI Inc.	4140	flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit	Roche Diagnostics	11796828001	Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps	Fisher Scientific	15340162	2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm	Sigma-Aldrich	G1277	glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer	Fisher Scientific	15-340-163	bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X	Sigma-Aldrich	C8740	lysis reagent
Platinum Taq polymerase	Invitrogen	10966-018	Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix	Invitrogen	18427-088	10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106	Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System	Thermo Fisher	B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder	Thermo Fisher	10488-085	DNA ladder