Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico
Summary
Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente é um método utilizado em estudos de saúde ocupacional para identificar riscos para a saúde. Este protocolo descreve a extração de DNA de amostras de ar ocupacional para amplificação e sequenciamento de regiões ITS fúngicas. Esta abordagem detecta muitas espécies de fungos que podem ser negligenciados pelos métodos tradicionais de avaliação.
Abstract
Métodos tradicionais de identificação fúngicas exposições em ambientes ocupacionais, tais como cultura e abordagens baseadas em microscopia, tem várias limitações que resultaram na exclusão de muitas espécies. Avanços no campo nas últimas duas décadas têm levado pesquisadores saúde ocupacional recorrer a abordagens baseadas em molecular para a identificação de riscos de fungos. Esses métodos resultaram na detecção de muitas espécies dentro de ambientes interiores e profissionais que não foram detectados usando métodos tradicionais. Este detalhes de protocolo amostras de uma abordagem para determinação de diversidade de fungosa no ar através de extração de DNA genômica, amplificação, sequenciamento e identificação taxonômica de fungos interna transcritos regiões espaçador (ITS). SEUS resultados de sequenciamento na detecção de muitas espécies de fungos que são não detectados ou difíceis de identificar ao nível de espécie, usando a cultura ou a microscopia. Enquanto esses métodos não fornecer medidas quantitativas da carga fúngica, eles oferecem uma nova abordagem para identificação de perigo e podem ser usados para determinar a riqueza global de espécies e diversidade dentro de um ambiente ocupacional.
Introduction
Exposições de fungosas em ambientes interiores e ocupacionais podem resultar em morbidades respiratórias, incluindo a sensibilização alérgica e asma1. Identificação de perigos fúngicas é importante para avaliar o risco e evitar a exposição do trabalhador. Estes perigos fúngicos podem ser resultado de contaminação interna, intrusão de ar exterior ou perturbações ambientais que resultam no transporte de materiais fúngicos em áreas onde os trabalhadores estejam presentes2. Métodos para avaliar a exposição fúngica incluem amostragem cultura viável, bem como a identificação microscópica de esporos fúngicos. Estas abordagens têm várias limitações e muitas vezes ignoram muitas espécies de fungos que poderiam estar contribuindo para a carga geral fúngica3. Abordagens baseadas em cultura só podem diferenciar esses organismos fúngicos viáveis que podem ser cultivados em meios nutritivos. Identificação de esporos de fungos, a nível da espécie através de microscopia pode ser confundido por esporos partilha morfologias semelhantes. Ambos os métodos são altamente dependentes de micologistas para analisar e identificar as espécies de fungos, com muitos remanescentes não identificado.
Para aperfeiçoar metodologias existentes usadas em avaliações de exposição e identificação de risco ocupacional, muitos pesquisadores se voltaram para tecnologias baseadas em molecular. Abordagens de sequenciamento para avaliar a diversidade microbiana em ambientes interiores e ocupacionais revelou um amplo espectro de espécies de fungos encontrados em comparação com métodos tais como a microscopia e cultura viável3,4 ,5. O método aqui apresentado descreve a amostragem do ar de ambientes ocupacionais e extração de DNA genômico para a identificação de potenciais riscos de fungos. Identificação de perigo é realizada por sequenciamento nuclear ribosomal espaçador transcrito interno, o ITS, regiões que são altamente variáveis entre fungos e tem sido comumente usadas para diferenciar espécies de fungos6,7, 8,9. Muitas espécies encontraram em ambientes ocupacionais, tais como algumas espécies do filo Basidiomycota, não são identificáveis na cultura viável e são difíceis de diferenciar ao microscópio. Estes fungos têm sido observados em abundância relativa alta dentro de ambientes interiores e profissionais avaliados pelo sequenciamento fúngicas ITS regiões3,4,10. SEU sequenciamento proporcionou maior conhecimento para a diversidade de fungos encontrados nos ambientes de interiores e ocupacionais.
O protocolo descrito aqui detalhes os métodos usados para coletar, extrair e amplificar fúngicas ITS regiões de Bioaerossóis para análise de sequências. Esta abordagem utiliza o Instituto Nacional de segurança ocupacional e saúde (NIOSH) amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios coletar partículas no ar. Este amostrador foi desenvolvido para coletar Bioaerossóis e separado respirável (≤ 4 µm de diâmetro aerodinâmico) e não-respirável (> 4 µm de diâmetro aerodinâmico) partículas, que permite a identificação de organismos fúngicos dentro de ambientes internos que são mais provável ser inaladas por um trabalhador11. Outros amostradores de ar, incluindo samplers de ciclone, estão disponíveis no mercado que têm a capacidade de coletar partículas dentro da faixa respirável (< 4 µm) usando filtros de12,13. Em contraste, o amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios NIOSH separa com base em seu diâmetro aerodinâmico em descartáveis, polipropileno tubos que podem ser processados imediatamente para aplicações a jusante14espécies de fungos.
Os processos de extração de DNA genômico e amplificando as regiões ITS fúngicas são detalhados no presente protocolo. As metodologias de extração apresentadas foram desenvolvidas especificamente para a extração de DNA genômico de fungos e bactérias, como muitos jogos comerciais como alvo de leveduras especificamente15, bactérias ou células de mamíferos. Os primers utilizados neste estudo são selecionados com base em sua cobertura global de ambos os fungos 1 ITS e ITS 2 regiões4,5. Sequenciamento destas regiões permite a comparação de muitas sequências ITS bancadas, incluindo aqueles essa sequência região ITS 1, a 2 de sua região ou regiões o ITS 1 e 2 ITS. A diversidade de fungosa de amostras de ar coletadas em uma configuração interior usando que esses métodos são mostrados, revelando um número substancial de sequências colocadas nos filos Ascomycota e Basidiomycota, bem como outras sequências pertencentes a menos dominantes filos de fungos, tais como Zygomycota. A ampla diversidade de sequências fungosas identificados usando esta abordagem não desejaria ser capturada utilizando metodologias de identificação de risco tradicionais como cultivo ou microscopia. Sequenciamento de regiões ITS fúngicas fornece um método aprimorado para identificar riscos de fungos e permitir uma melhor compreensão das exposições fúngicas indoor e ocupacionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente ocupacional, usando abordagens baseadas em sequenciamento melhorou a avaliação identificação e exposição de risco de fungos. Usando essa abordagem tem permitido a detecção de muitas espécies de fungos adicionais que muitas vezes não são detectados usando métodos baseados em microscopia de avaliação ou cultura. Um método de amostragem Bioaerossóis de ambientes interiores e ocupacionais e a extração de DNA genômico de amostras de ar para sua amplifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por um acordo interinstitucional entre o NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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