संग्रह और कवक डीएनए के विश्लेषण के लिए व्यावसायिक हवा के नमूनों की निकासी
Summary
एक वातावरण के भीतर कवक विविधता का निर्धारण एक व्यावसायिक स्वास्थ्य अध्ययन में उपयोग के लिए स्वास्थ्य खतरों की पहचान विधि है । यह प्रोटोकॉल कवक अपने क्षेत्रों के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए व्यावसायिक हवा के नमूनों से डीएनए निष्कर्षण का वर्णन करता है । इस दृष्टिकोण कई कवक प्रजातियों कि पारंपरिक आकलन के तरीकों से अनदेखी की जा सकती है का पता लगाता है ।
Abstract
व्यावसायिक वातावरण में फंगल जोखिम की पहचान के पारंपरिक तरीकों, जैसे संस्कृति और सूक्ष्म आधारित दृष्टिकोण, कई सीमाएं है कि अनेक प्रजातियों के अपवर्जन में हुई है । पिछले दो दशकों में क्षेत्र में अग्रिम व्यावसायिक स्वास्थ्य शोधकर्ताओं ने कवक खतरों की पहचान के लिए आणविक आधारित दृष्टिकोण को बारी करने के लिए नेतृत्व किया है । इन पद्धतियों इनडोर और व्यावसायिक वातावरण है कि पारंपरिक तरीकों का उपयोग नहीं पाया गया है के भीतर कई प्रजातियों का पता लगाने में हुई है । इस प्रोटोकॉल का विवरण जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, प्रवर्धन, अनुक्रमण, और फफूंद आंतरिक लिखित स्पेसर (इसके) क्षेत्रों के वर्गीकरण की पहचान के माध्यम से हवा के नमूनों के भीतर कवक विविधता का निर्धारण करने के लिए एक दृष्टिकोण । कई कवक प्रजातियों का पता लगाने में इसके अनुक्रमण परिणाम है कि या तो पता नहीं या मुश्किल प्रजातियों के स्तर की पहचान करने के लिए संस्कृति या माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं । हालांकि इन तरीकों कवक बोझ के मात्रात्मक उपाय प्रदान नहीं करते हैं, वे खतरा पहचान के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करते है और एक व्यावसायिक वातावरण में समग्र प्रजातियों समृद्धि और विविधता का निर्धारण किया जा सकता है ।
Introduction
इनडोर और व्यावसायिक वातावरण में फफूंद जोखिम, एलर्जी संवेदीकरण और अस्थमा1सहित सांस की रुग्णता में परिणाम कर सकते हैं । कवक खतरों की पहचान जोखिम का आकलन करने और कामगार जोखिम को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इन कवक खतरों इनडोर संदूषण, आउटडोर हवा घुसपैठ, या पर्यावरणीय गड़बड़ी है कि उन क्षेत्रों में कवक सामग्री के परिवहन में परिणाम है, जहां श्रमिकों2मौजूद है का परिणाम हो सकता है । कवक जोखिम का आकलन करने के तरीकों व्यवहार्य संस्कृति नमूना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कवक बीजाणुओं की सूक्ष्म पहचान शामिल है । इन तरीकों कई सीमाएं है और अक्सर कई कवक प्रजातियों कि समग्र कवक बोझ3के लिए योगदान हो सकता है नजरअंदाज । संस्कृति आधारित दृष्टिकोण केवल उन व्यवहार्य कवक जीवों कि पोषक तत्व मीडिया पर खेती की जा सकती है अंतर कर सकते हैं । सूक्ष्मता के माध्यम से प्रजातियों के स्तर को कवक बीजाणुओं की पहचान के समान morphologies साझा करने वाले बीजाणुओं द्वारा पाया जा सकता है । दोनों तरीकों mycologists पर अत्यधिक निर्भर है विश्लेषण और कवक प्रजातियों की पहचान, कई शेष अज्ञात के साथ ।
मौजूदा व्यावसायिक जोखिम पहचान और जोखिम आकलन में इस्तेमाल के तरीकों पर सुधार करने के लिए, कई शोधकर्ताओं आणविक आधारित प्रौद्योगिकियों के लिए बदल गया है । इनडोर और व्यावसायिक वातावरण के भीतर माइक्रोबियल विविधता का आकलन करने के लिए अनुक्रमण आधारित दृष्टिकोण इस तरह के सूक्ष्म और व्यवहार्य संस्कृति3,4 के रूप में तरीकों की तुलना में कवक प्रजातियों का सामना करना पड़ा की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से पता चला है ,5. यहां प्रस्तुत विधि व्यावसायिक वातावरण और संभावित कवक खतरों की पहचान के लिए जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण के हवा नमूना वर्णन करता है । जोखिम पहचान परमाणु राइबोसोमल आंतरिक लिखित स्पेसर, या इसके, क्षेत्रों है कि कवक के बीच अत्यधिक चर रहे है अनुक्रमण द्वारा पूरा किया है और सामांयतः कवक प्रजातियों में अंतर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है6,7, 8,9. ऐसी कुछ प्रजातियों के रूप में व्यावसायिक सेटिंग्स में पाया कई प्रजातियों, जाति Basidiomycota से संबंधित, व्यवहार्य संस्कृति में पहचाने जाने योग्य नहीं हैं और microscopically अंतर करने के लिए मुश्किल हैं. इन कवक उच्च सापेक्ष बहुतायत में इनडोर और व्यावसायिक परिवेशों के अनुक्रमण कवक अपने क्षेत्रों में3,4,10द्वारा मूल्यांकनकेभीतर मनाया गया है । इसके अनुक्रमण इनडोर और व्यावसायिक वातावरण के भीतर का सामना करना पड़ा कवक की विविधता में अधिक से अधिक ज्ञान प्रदान की गई है ।
प्रोटोकॉल यहां वर्णित विवरण के लिए इकट्ठा, निकालने, और क्रम विश्लेषण के लिए एयरोसोल से कवक अपने क्षेत्रों बढ़ाना इस्तेमाल किया तरीकों । इस दृष्टिकोण को हवा में कण इकट्ठा करने के लिए व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य (NIOSH) दो चरण चक्रवात एयरोसोल नमूना के लिए राष्ट्रीय संस्थान का इस्तेमाल करता है । इस पारखी को और अलग respirable (≤ 4 µm बेधड़क व्यास) और गैर respirable (> 4 µm बेधड़क व्यास) कणों, जो इनडोर वातावरण के भीतर कवक जीवों की पहचान के लिए अनुमति देता है कि सबसे अधिक कर रहे हैं इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया था एक कार्यकर्ता11से सांस की संभावना । चक्रवात नमूना सहित अन्य हवा नमूना, बाजार है कि respirable रेंज (< 4 µm) फिल्टर12,13का उपयोग कर के भीतर कणों को इकट्ठा करने की क्षमता है पर उपलब्ध हैं । इसके विपरीत, NIOSH दो चरण चक्रवात एयरोसोल पारखी डिस्पोजेबल में अपने बेधड़क व्यास के आधार पर कवक प्रजातियों अलग करती है, कि तुरंत बहाव अनुप्रयोगों14के लिए संसाधित किया जा सकता है ।
जीनोमिक डीएनए निकालने की प्रक्रिया और कवक अपने क्षेत्रों बढ़ाना इस प्रोटोकॉल में विस्तृत रहे हैं । निष्कर्षण के तरीके में प्रस्तुत कवक और बैक्टीरिया से जीनोमिक डीएनए की निकासी के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया है, के रूप में कई वाणिज्यिक किट लक्ष्य स्तनधारी कोशिकाओं, बैक्टीरिया, या विशेष रूप से15जिये. इस अध्ययन में इस्तेमाल प्राइमरों दोनों कवक इसके 1 और उसके 2 क्षेत्रों के4,5के अपने समग्र कवरेज के आधार पर चुना जाता है । इन क्षेत्रों के sequencing कई बैंक अपने दृश्यों की तुलना के लिए अनुमति देता है, उन है कि अनुक्रम अपने 1 क्षेत्र, अपने 2 क्षेत्र, या दोनों अपने 1 और उसके 2 क्षेत्रों सहित । इन तरीकों का उपयोग कर एक इनडोर सेटिंग में एकत्र हवा के नमूनों की कवक विविधता दिखाया जाता है, संघ Ascomycota और Basidiomycota के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य अनुक्रम कम प्रमुख कवक संघ से संबंधित में रखा दृश्यों की एक पर्याप्त संख्या का खुलासा, जैसे Zygomycota । इस दृष्टिकोण का उपयोग कर की पहचान की कवक दृश्यों की व्यापक विविधता खेती या माइक्रोस्कोपी की तरह पारंपरिक जोखिम पहचान के तरीके का उपयोग कर कब्जा नहीं किया जाएगा. फंगल अपने क्षेत्रों के अनुक्रमण कवक खतरों की पहचान और इनडोर और व्यावसायिक कवक जोखिम की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देने के लिए एक बढ़ाया विधि प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक व्यावसायिक वातावरण के भीतर कवक विविधता का निर्धारण sequencing आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कवक खतरा पहचान और जोखिम आकलन में सुधार हुआ है । इस दृष्टिकोण का उपयोग कई अतिरिक्त कवक प्रजातियों का पता लगाने के लि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIOSH और NIEHS (AES12007001-1-0-6) के बीच एक एजेंसी के समझौते के हिस्से में समर्थित किया गया था ।
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
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