יצירת מודל גיאומטרי מבנית מציאותי סופיים של Cardiomyocyte ללמוד את התפקיד של אדריכלות הסלולר Cardiomyocyte במערכות ביולוגיות
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודל מפורט במרחב סופיים של הארכיטקטורה תאיים של cardiomyocytes מיקרוסקופ אלקטרונים ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כוחו של המודל מפורט במרחב הזה הוכח באמצעות חקרי מקרה סידן איתות, ביואנרגיה.
Abstract
עם כניסתו של טכנולוגיות הדמיה תלת מימדי (3D) כגון טומוגרפיה של אלקטרון, סדרתי-בלוק-פרצוף סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית, הקהילה המדעית יש גישה חסרת תקדים אלגוריתמית תת מיקרומטר רזולוציה המאפיינות את שיפוץ אדריכלי זה מלווה שינויים בתפקוד cardiomyocyte על בריאות ומחלה. עם זאת, אלה נתונים (datasets) היה תחת שימוש עבור חוקרים את התפקיד של אדריכלות הסלולר שיפוץ בפונקצית cardiomyocyte. המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר כיצד ליצור מודל מדויק סופיים של cardiomyocyte באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מודל מפורט ומדויק של אדריכלות הסלולר יש פוטנציאל משמעותי לספק תובנות חדשות cardiomyocyte ביולוגיה, יותר מאשר ניסויים לבד יכול גארנר. הכוח של שיטה זו טמון ביכולתה שהמפתחות מיזוג מידע מתוך שתי שיטות הדמיה ובתחזוקה של cardiomyocyte ultrastructure לפתח מודל אחד מאוחד ומפורט של cardiomyocyte. פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי לשלב את האלקטרונים טומוגרפיה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של מבוגרים cardiomyocytes חולדה זכר Wistar (שם עבור סוג מסויים של לבקן עכברוש) לפתח מודל חצי-סרקומר סופיים של cardiomyocyte. ההליך יוצר דגם תלת-ממד סופיים המכיל של תיאור מדויק, ברזולוציה גבוהה (גודל ~ 35 ננומטר) של ההתפלגות של המיטוכונדריה, myofibrils אשכולות קולטן ryanodine לשחרר את הסידן הדרוש עבור cardiomyocyte התכווצות מהרשת רשתי sarcoplasmic (SR) לתוך myofibril תא cytosolic. המודל שנוצר כאן כפי המחשה שאינו כולל הפרטים של הארכיטקטורה צנורית-רוחבי או מהרשת רשתי sarcoplasmic, ולכן מודל מינימלי של cardiomyocyte. ובכל זאת, הדגם ניתן כבר ליישם מבוסס סימולציה חקירות את תפקיד של מבנה תאים בסידן איתות, מיטוכונדריאלי ביואנרגיה, אשר מומחש ודן באמצעות שני מחקרים בתיק המוצגים הבאים פרוטוקול מפורט.
Introduction
צימוד עירור-התכווצות (ECC) בלב מתייחס חשוב ומורכב צימוד בין עירור חשמלי של קרום cardiomyocyte התכווצות מכנית עוקבות של התא במהלך כל פעימת לב. מודלים מתמטיים יש תפקיד מפתח בפיתוח הבנה כמותית של תהליכים ביוכימיים היררכיות המסדירים את פוטנציאל הפעולה1, סידן cytosolic איתות2, ביואנרגיה3, ובעקבות יצירת כח כויץ. מודל שכזה גם בהצלחה לחזות שינויים פעימות הלב כאשר אחד או מספר תהליכים ביוכימיים אלה עוברים שינויים4,5. Ultrastructure מאורגן של cardiomyocyte הוכרה יותר ויותר כדי לשחק תפקיד קריטי הפונקציה כויץ נורמלי של התא לבין בלב שלם. אכן, מתרחשים שינויים מורפולוגיה וארגון של רכיבי ultrastructure לב במקביל לשינויים ביוכימיים בתנאים מחלות כגון היפרטרופיה6, אי ספיקת לב7קרדיומיופתיה סוכרת8. בין אם שינויים מבניים אלה הן התגובות קלים, גמישים או פתולוגית שינוי תנאי הביוכימי הוא עדיין אינו מודע לקיומם9. המושבים מטבעו צר בין צורה ופונקציה בביולוגיה אומר כי מחקרים ניסיוניים לבד לא יכול לספק תובנות עמוקות יותר מאשר מתאמים בין שיפוץ מבנה ותפקוד cardiomyocyte. דור חדש של מודלים מתמטיים ניתן לשלב את מכלול מבנית של מרכיבי תת הסלולר, יחד עם תהליכים ביוכימיים, למד היטב נחוצים לפתח הבנה מקיפה, כמותית של מערכת היחסים בין מבנה, ביוכימיה כויץ בכוח cardiomyocytes. פרוטוקול זה מתאר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור מודלים סופיים מדויק מבחינה מבנית של cardiomyocytes יכול לשמש עבור חקירות.
בעשור האחרון ראה התקדמות משמעותית מיקרוסקופ אלקטרונים 3D10קונאפוקלית11, מיקרוסקופיה סופר רזולוציה12 המספקים תובנות הרכבה בקנה מידה ננו, מיקרו-מידה של חסר תקדים, ברזולוציה גבוהה רכיבי משנה הסלולר cardiomyocyte. לאחרונה, datasets אלה שימשו כדי ליצור מודלים של cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16. מודלים אלה להשתמש ומבוססת הנדסה הדמיה שיטה, הנקראת שיטת סופיים17, כדי ליצור סופיים חישובית רשתות על אילו תהליכים ביוכימיים, cardiomyocyte ניתן לדמות התכווצויות. עם זאת, מודלים אלה מוגבלים על ידי הרזולוציה ואת פירוט שיטת מיקרוסקופ שיכול לספק ב- dataset התמונה. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להפיק ננומטר ברמת פירוט מבנה התא, אבל קשה לזהות חלבונים ספציפיים בתוך התמונה זה יהיה צורך ליצור מודל. מצד שני, מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה סופר יכול לספק תמונות חדות גבוהה ברזולוציות גודל 50 ננומטר מרכיבים בלבד בחר כמה מולקולרית של התא. רק באמצעות שילוב של שיטות הדמיה אלה משלימים מידע יכולים אחת מעשית לחקור את הרגישות של פונקציה לשינויים במבנה. אור correlative ואלקטרון עדיין לא הליך שגרתי, זה עדיין יסבול המגבלה כי רק מספר מוגבל של רכיבים יכול להיות מוכתם בתצוגה immunofluorescence, בקורלציה עם הנוף מיקרוסקופ אלקטרונים.
פרוטוקול זה מציג הגישה הרומן18 העושה שימוש בשיטות סטטיסטיות19 כדי לנתח שהמפתחות נתיך מיקרוסקופ אור מידע על התפלגות מרחבית של תעלות יונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים מידע על הלב אחרים ultrastructure רכיבים, כגון myofibrils של המיטוכונדריה. זה מייצרת מודל סופיים יכול לשמש עם מודלים ביופיזיקלי של תהליכים ביוכימיים ללמוד את התפקיד של הארגון תת הסלולר cardiomyocyte תהליכים ביוכימיים המסדירים התכווצות cardiomyocyte. לדוגמה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ליצור מודלים של בריאה, streptozotocin-induced נייטרלים לב סוכרתית לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב תא זה הוא ציין חיה סוכרתית מודלים8. יתרון נוסף של מהות השיטה הציג סטטיסטי מומחש גם בפרוטוקול: השיטה ניתן להפיק מופעים מרובים של גיאומטריות סופיים מקרוב לחקות את הווריאציות השפעול שנצפה במבנה התא.
כמו סקירה, השלבים פרוטוקול כוללים: (i) הכנה של רקמת הלב מיקרוסקופ ליצור תמונות 3D עם רזולוציה וניגודיות מספיק; (ii) שחזור ואת פילוח של אוספי תמונות 3D של מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 3D שחזור וניתוח התמונה תוכנה בשם IMOD20; (iii) שתשמש את iso2mesh21 ליצירת רשת סופיים באמצעות הנתונים מקוטע כקלט; (iv) באמצעות אלגוריתם הרומן קודים כדי למפות את ההפצה של תעלות יונים על גבי רשת השינוי סופיים.
הנחת היסוד של הגישה לקבר כל שלב המותווה בתוך הפרוטוקול, התוצאות נציג הינם מסופקים בכל הדמויות הנלוות. סקירה מחולקת לרמות המציין כיצד ניתן להשתמש הדגמים מפורט במרחב שנוצר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של סידן במהלך ECC, וכן מיטוכונדריאלי ביואנרגיה. חלק מהמגבלות הנוכחי של הפרוטוקול נידונות, כמו גם פיתוחים חדשים אשר נמצאות בעיצומן להתגבר עליהם, לקדם הבנה כמותית של התפקיד של מבנה תאים מערכות הלב לביולוגיה. מופנית גם כמה שיטות אלה יכול להכליל ליצור מודלים סופיים של סוגי תאים אחרים.
משתמשים של פרוטוקול זה יכול לדלג על שלב 1 ואת החלק שחזור של שלב 2 אם יש להם גישה לאוסף תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הקיימת מראש. משתמשים אשר מתכוונים לרכוש את הנתונים שלהם בשיתוף עם microscopists אלקטרון מנוסים יותר ייתכן שתרצה לדון ולהשוות את הקיבעון ואת הנהלים מכתימים בשלב 1 עם המומחה כדי לקבוע פרוטוקול אופטימלית עבור רכישת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מתאר את השלבים החשובים ליצירת מודל גיאומטרי סופיים הרומן של cardiomyocyte ultrastructure. השיטה מאפשרת פיוז’ן חישובית מיקרוסקופיה שונים (או, באופן עקרוני, נתונים אחרים) שיטות לפיתוח מודל חישובי מקיף יותר של הדינמיקה cardiomyocyte הכולל פרטים של ארכיטקטורה התא מרחבית. אין כרגע שום פרוטוקול אחר ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי את המלוכה בחברה של ניו זילנד מרסדן מהר להתחיל גרנט 11-UOA-184, המענק האנושי גבולות המדע תוכנית מחקר RGP0027 2013, את אוסטרליה מחקר המועצה גילוי פרוייקט גרנט DP170101358.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. – Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. – Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. . The finite element method. 1, (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. . Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
