Creazione di un modello geometrico strutturalmente realistico agli elementi finiti di un Cardiomyocyte per studiare il ruolo dell'architettura cellulare in biologia dei sistemi del Cardiomyocyte
Summary
Questo protocollo descrive un nuovo metodo per creare un modello ad elementi finiti spazialmente dettagliate dell’architettura intracellulare dei cardiomiociti da microscopia elettronica e immagini di microscopia confocale. Il potere di questo modello spazialmente dettagliato è dimostrato mediante studi di caso nella segnalazione di calcio e bioenergetica.
Abstract
Con l’avvento di tridimensionale (3D) tecnologie di imaging come la tomografia elettronica, serial-blocco-faccia microscopia elettronica e confocale, la comunità scientifica ha accesso senza precedenti a DataSet di grandi dimensioni alle sub-micrometriche risoluzione che caratterizzano la ristrutturazione architettonica che accompagna i cambiamenti nella funzione del cardiomyocyte nella salute e nella malattia. Tuttavia, tali set di dati sono state sotto-utilizzate per investigare il ruolo dell’architettura cellulare che ritocca in funzione dei cardiomiociti. Lo scopo del presente protocollo è illustrato come creare un modello ad elementi finiti accurata di un cardiomyocyte usando microscopia elettronica ad alta risoluzione e immagini di microscopia confocale. Un dettagliato e preciso modello di architettura cellulare ha un potenziale significativo per fornire nuove intuizioni del cardiomyocyte biologia, più di esperimenti da solo possono raccogliere. La potenza di questo metodo risiede nella sua capacità di fondere computazionalmente informazioni da due diverse modalità di imaging di cardiomyocyte ultrastruttura di sviluppare un modello unificato e dettagliato dei cardiomiociti. Questo protocollo viene descritta la procedura per integrare tomografia elettronica e immagini di microscopia confocal di adulto maschi cardiomiociti di ratto Wistar (nome per una specifica razza di ratto dell’albino) per sviluppare un modello agli elementi finiti emisarcomero del cardiomyocyte. La procedura genera un modello 3D agli elementi finiti che contiene una rappresentazione accurata, ad alta risoluzione (dell’ordine di ~ 35 nm) della distribuzione dei mitocondri, miofibrille e cluster di recettore rianodinico che rilasciano il calcio necessario per cardiomyocyte contrazione della rete reticolare sarcoplasmatico (SR) nella miofibrilla e vano citosolico. Il modello generato qui come un’illustrazione non incorporare dettagli dell’architettura tubulo trasverso o la rete reticolare sarcoplasmatica ed è quindi un modello minimo dei cardiomiociti. Tuttavia, il modello può essere applicato già nelle indagini basate su simulazione nel ruolo della struttura cellulare in bioenergetica mitocondriale e segnalazione del calcio, che è illustrato e discusso con due studi di casi che vengono presentati seguendo le protocollo dettagliato.
Introduction
Accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) nel cuore si riferisce all’importante e intricato di accoppiamento tra eccitazione elettrica della membrana dei cardiomiociti e la successiva contrazione meccanica della cella durante ogni battito cardiaco. Modelli matematici hanno giocato un ruolo chiave nello sviluppo di una comprensione quantitativa dei processi biochimici interconnessi che regolano il potenziale d’azione1, il calcio citosolico segnalazione2, bioenergetica3e successive generazione di forza contrattile. Tali modelli hanno predetto con successo anche le modifiche per il battito cardiaco quando uno o più di questi processi biochimici subiscono alterazioni4,5. L’ultrastruttura altamente organizzato del cardiomyocyte sempre più è stato riconosciuto un ruolo critico nella funzione contrattile normale della cellula e tutto il cuore. Infatti, si verificano modifiche alla morfologia e organizzazione delle componenti della ultrastruttura cardiaca in parallelo ai cambiamenti biochimici in termini di malattia quali ipertrofia6, insufficienza cardiaca7e8di cardiomiopatia diabetica. Se questi cambiamenti strutturali sono minori, adattive o patologiche risposte al mutare le condizioni biochimiche è ancora in gran parte sconosciuto9. L’accoppiamento intrinsecamente stretto tra forma e funzione in biologia significa che gli studi sperimentali da solo non possono fornire più profonde intuizioni di correlazioni tra rimodellamento strutturale e funzione dei cardiomiociti. Una nuova generazione di modelli matematici che possono integrare l’assemblea strutturale dei componenti sub-cellulari, insieme con i processi biochimici ben studiati, sono necessari per sviluppare una comprensione completa, quantitativa del rapporto tra struttura, biochimica e forza contrattile in cardiomiociti. Questo protocollo descrive i metodi che possono essere utilizzati per generare modelli agli elementi finiti strutturalmente accurati dei cardiomiociti che possono essere utilizzati per tali indagini.
L’ultimo decennio ha visto progressi significativi nella microscopia 3D10, confocale11e di microscopia di Super-risoluzione12 che forniscono approfondimenti senza precedenti, ad alta risoluzione nell’assembly su scala nano e micro-scala della componenti sub-cellulari del del cardiomyocyte. Recentemente, questi set di dati sono stati utilizzati per generare modelli computazionali di cardiomyocyte ultrastruttura13,14,15,16. Questi modelli utilizzano un metodo di simulazione ingegneria ben consolidata, chiamato il metodo agli elementi finiti17, per creare elementi finiti reticoli computazionali su cui processi biochimici e del cardiomyocyte contrazioni possono essere simulate. Tuttavia, questi modelli sono limitati dalla risoluzione e dettaglio che può fornire un metodo di microscopia in un set di dati di immagine. Ad esempio, la microscopia elettronica in grado di generare nanometro-livello dettaglio della struttura cellulare, ma è difficile identificare proteine specifiche all’interno dell’immagine che sarebbe necessario per creare un modello. D’altra parte, microscopia ottica super-risoluzione in grado di fornire immagini ad alto contrasto a risoluzioni dell’ordine di 50 nm di solo un selezionare alcuni componenti molecolari della cellula. Solo integrando le informazioni complementari da queste modalità di imaging si può realisticamente esplorare la sensibilità della funzione cambiamenti nella struttura. Correlativo luce e microscopia elettronica non è ancora una procedura di routine e ne deriverebbe ancora la limitazione che solo un numero limitato di componenti potrebbe essere macchiato nella visualizzazione immunofluorescenza e correlato con la vista di microscopia elettronica.
Questo protocollo presenta un nuovo approccio18 che utilizza metodi statistici19 per analizzare e computazionalmente fusibile microscopia chiara informazioni sulla distribuzione spaziale dei canali ionici con microscopia elettronica informazioni su altri cardiaco componenti, ultrastruttura, quali miofibrille e mitocondri. Questo produce un modello agli elementi finiti che può essere utilizzato con modelli biofisici di processi biochimici per studiare il ruolo dell’organizzazione subcellulare dei cardiomiociti sui processi biochimici che regolano la contrazione dei cardiomiociti. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per creare modelli da sano e miociti cardiaci diabetici streptozotocin-indotti per studiare l’effetto di rimodellamento strutturale sulla funzione delle cellule cardiache che è osservata in animali diabetici modelli8. Un ulteriore vantaggio della natura statistica del metodo presentato è illustrato anche nel protocollo: il metodo può generare più istanze di geometrie di elementi finiti che imitano molto attentamente le variazioni sperimentalmente osservate nella struttura delle cellule.
Come una panoramica, la procedura di protocollo comprende: (i) preparazione del tessuto cardiaco per microscopia elettronica generare immagini 3D con sufficiente risoluzione e contrasto; (ii) ricostruzione e segmentazione delle serie di immagini 3D da microscopia elettronica dati utilizzando una ricostruzione 3D di microscopia elettronica e software di analisi di immagine denominato IMOD20; (iii) utilizzando iso2mesh21 per generare una mesh di elementi finiti utilizzando i dati segmentati come input; (iv) utilizzando l’algoritmo romanzo e codici per mappare la distribuzione dei canali ionici sulla maglia di elementi finiti.
La premessa dell’approccio ad ogni passaggio è descritto all’interno del protocollo e risultati rappresentativi sono previste le figure di accompagnamento. Una panoramica è delineata che specifica come i modelli spazialmente dettagliati generati possono essere utilizzati per studiare la dinamica spaziale di calcio durante ECC, nonché bioenergetiche mitocondriali. Alcune delle attuali limitazioni del protocollo sono discusse, così come nuovi sviluppi che sono in corso per superarli e promuovere una comprensione quantitativa del ruolo della struttura cellulare di biologia dei sistemi cardiaco. Si rivolge anche come questi metodi potrebbero essere generalizzati per creare modelli ad elementi finiti di altri tipi cellulari.
Gli utenti del presente protocollo possono saltare la fase 1 e la parte di ricostruzione del passaggio 2 se hanno accesso a una serie di immagini di microscopia elettronica pre-esistenti. Gli utenti che intendono acquisire i loro dati in collaborazione con più esperti microscopisti dell’elettrone potrebbero desiderare discutere e confrontare la fissazione e colorazione procedure nel passaggio 1 con l’esperto per determinare un protocollo ottimale per l’acquisizione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di cui sopra illustra passaggi chiave per generare un modello geometrico del romanzo agli elementi finiti di ultrastruttura dei cardiomiociti. Il metodo consente modalità di fusione computazionale di microscopia diversa (o, in linea di principio, altri dati) sviluppare un modello computazionale più completo della dinamica dei cardiomiociti che include dettagli di architettura spaziale delle cellule. Non esiste attualmente nessun altro protocollo disponibile per creare un modello di un cardiomyocyte.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Royal Society della Nuova Zelanda Marsden veloce avviare Grant 11-UOA-184, il Human Frontiers Science programma Research grant RGP0027/2013 e australiano di ricerca Consiglio Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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