Cardiomyocyte 시스템 생물학에서 세포 아키텍처의 역할을 연구 하기 Cardiomyocyte의 구조적으로 현실적인 유한 요소 형상 모델 생성
Summary
이 프로토콜은 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법 심상에서 cardiomyocytes의 세포내 구조의 공간적 상세한 유한 요소 모델을 생성 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 이 공간 세부 모델의 파워는 칼슘 신호 및 생체에서 사례 연구를 사용 하 여 보여 줍니다.
Abstract
3 차원 (3D) 영상 기술 전자 단층 촬영 등의 출현으로 시리얼-블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 검사 법, 과학계는 큰 데이터 집합에 액세스할 수 전례 없는 서브 마이크로미터에서 건축 개장 특징 해상도 cardiomyocyte 기능 건강 및 질병에 있는 변화를 동반 한다. 그러나, 이러한 데이터 집합 조사 cardiomyocyte 함수에 개장 하는 세포질 건축의 역할에 대 한 아래에 활용 되었습니다. 이 프로토콜의 목적은 cardiomyocyte 고해상도 전자 현미경 검사 법 그리고 confocal 현미경 이미지를 사용 하 여의 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 방법을 개요입니다. 세포질 건축의 상세 하 고 정확한 모델 cardiomyocyte 생물학, 실험 혼자 올릴 수 보다 더 많은에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 상당한 잠재력이 있다. 이 방법의 계산 cardiomyocyte는 cardiomyocyte의 한 통합 하 고 상세한 모델을 개발 하는 열 대권 외의 두 개의 서로 다른 이미지 형식에서 정보를 융합 하는 능력에 있다. 이 프로토콜은 전자 단층 촬영과는 cardiomyocyte의 반 sarcomere 유한 요소 모델을 개발 하기 위해 성인 남성 Wistar (알 비 노 쥐의 특정 품종에 대 한 이름) 쥐 cardiomyocytes의 confocal 현미경 이미지를 통합 하는 단계를 설명 합니다. 한 정확 하 고, 고해상도 묘사를 포함 하는 3 차원 유한 요소 모델을 생성 하는 절차 (순서 ~ 35 nm) 미토 콘 드리 아, myofibrils cardiomyocyte에 필요한 칼슘을 풀어 ryanodine 수용 체 클러스터 배포의 myofibril와 cytosolic 구획 sarcoplasmic 망상 네트워크 (SR)에서 수축. 생성 된 모델 여기 그림 가로 관 건축 또는 sarcoplasmic으로 네트워크의 세부 정보를 포함 하지 않습니다 이며 따라서는 cardiomyocyte의 최소한의 모델. 그럼에도 불구 하 고, 모델 이미에 적용할 수 있는 시뮬레이션 기반에 대 한 조사 역할의 셀 구조를 보여 줍니다 및 다음 표시 되는 두 개의 사례 연구를 사용 하 여 논의 칼슘 신호 및 미토 콘 드리 아 생체에는 자세한 프로토콜입니다.
Introduction
흥분-수축 커플링 (ECC)에 중요 하 고 복잡 한 cardiomyocyte 막의 전기 흥분 및 각 박동 동안 셀의 후속 기계 수축 사이의 커플링을 말합니다. 수학적 모델 활동 전위1,2,3, 생체 신호 cytosolic 칼슘을 조절 하는 류의 생화학 프로세스의 정량적 이해 개발에 중요 한 역할을 이후 수축 성 힘 세대입니다. 같은 모델도 성공적으로 예측 하나 하트 비트에 대 한 변경 또는이 생 화 확 적인 과정의 몇 가지 변경4,5를 받 다. cardiomyocyte의 높은 조직 열 대권 외 점점 셀 및 전체 심장의 정상적인 수축 성 기능에 중요 한 역할을 인정 받고 있습니다. 실제로, 형태학 및 심장 열 대권 외의 구성 요소의 조직 변경 비6,7, 심장 마비 그리고 당뇨병 심근8등 질병 조건에서 생 화 확 적인 변화에 동시에 발생합니다. 이러한 구조적인 변화는 변화에 대 한 사소한, 적응, 또는 병 적인 응답 생화학 조건 여전히 크게 알 수 없는9입니다. 형태와 생물학에서 기능 사이의 본질적으로 밀접 한 결합 실험 연구 혼자 개장 하는 구조와 cardiomyocyte 기능 사이의 상관 관계 보다 더 깊은 통찰력을 제공할 수 없습니다 의미 합니다. 잘 공부 생화학 프로세스 함께 하위 세포 구성 성분의 구조 어셈블리를 통합할 수 있는 수학적 모델의 새로운 세대는 관계의 종합적, 정량적 이해를 개발 하는 데 필요한 구조 사이, 생화학, cardiomyocytes에 수축 성 힘. 이 프로토콜 같은 수사를 위해 사용 될 수 있는 cardiomyocytes의 구조적으로 정확한 유한 요소 모델을 생성 하는 데 사용할 수 방법을 설명 합니다.
지난 10 년간 본 3D 전자 현미경10, confocal11및 슈퍼 해상도 현미경12 의 나노 및 마이크로 스케일 어셈블리에 대 한 전례 없는, 고해상도 통찰력을 제공 하는 중요 한 발전은 cardiomyocyte의 하위 세포질 구성 요소입니다. 최근, 이러한 데이터 집합 cardiomyocyte 열 대권 외의13,14,,1516의 계산 모델을 생성 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 모델 만들 유한 요소 계산 메시 생화학 프로세스 및 cardiomyocyte 수축 시뮬레이션할 수 유한 요소 방법17, 라는 잘 설립 엔지니어링 시뮬레이션 메서드를 사용 합니다. 그러나, 이러한 모델은 해상도 현미경 메서드는 이미지 데이터 집합에 제공할 수 있는 세부 사항에 의해 제한 됩니다. 예를 들어 전자 현미경의 셀 구조를 나노미터 수준의 세부를 생성할 수 있습니다 하지만 그것은 이미지 모델을 만드는 데 필요한 것입니다 내에서 특정 단백질을 파악 하기가 어렵습니다. 최고 해결책 광학 현미경 해상도 50 순서에서 높은 콘트라스트 이미지를 제공할 수 있는 다른 한편으로만 선택 몇 분자의 구성 요소는 셀의 nm. 만 이러한 이미징 형식에서 상호 보완적인 정보를 통합 하 여 둘러볼 수 있습니다 하나 현실적으로 기능의 감도 변화 구조에. 상호 빛과 전자 현미경 검사 법은 여전히 일상적인 절차 그리고 그것은 여전히 제한만 제한 된 수의 구성 요소 면역 형광 보기에서 스테인드 하 고 전자 현미경 보기와 상관 수를 겪을 것입니다.
이 프로토콜 선물 통계적 방법19 를 사용 하 여 분석 하 고 계산 다른 심장에 대 한 전자 현미경 정보 이온 채널의 공간 분포에 가벼운 현미경 검사 법 정보를 융합 하는 새로운 접근 방식을18 열 대권 외의 구성 요소, myofibrils 미토 콘 드리 아 등입니다. 이 생 화 확 적인 과정의 생물 모델 cardiomyocyte 수축 조절 하는 생 화 확 적인 프로세스에 cardiomyocyte 하위 세포 조직의 역할을 연구 하기 사용 될 수 있는 유한 요소 모델을 생성 합니다. 예를 들어이 프로토콜에서 건강 한 모델을 만드는 데 사용할 수 하 고 당뇨병 동물에서 관찰 되는 심장 세포 기능에 구조 리 모델링의 효과 연구를 당뇨병 심장 myocytes streptozotocin 유발 모델8. 제시 방법의 통계 자연의 추가적인 이점은 또한 프로토콜에서 설명 된다: 방법을 유한 요소 기 하 도형 셀 구조에 실험적으로 관찰 된 변화를 밀접 하 게 모방의 여러 인스턴스를 생성할 수 있습니다.
개요, 프로토콜 단계 포함 됩니다: (i) 충분 한 해상도 및 대비; 3D 이미지를 생성 하는 전자 현미경에 대 한 심장 조직의 준비 (ii) 재건 및 3D 이미지 스택 3D 전자 현미경 재건 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 전자 현미경 검사 법 데이터에서의 시장 세분화 라는 아이 모드20; (iii)를 사용 하 여 iso2mesh21 입력;으로 세그먼트 데이터를 사용 하 여 유한 요소 메쉬 생성 (4) 사용 하 여 새로운 알고리즘 및 코드 유한 요소 메쉬에 이온 채널의 분포를 매핑하는 데.
각 단계에 대 한 접근의 전제는 프로토콜 내에서 설명 하는 및 대표 결과 동반 숫자에서 제공 됩니다. ECC, 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 생체 칼슘의 공간적 역학 공부 하 생성 된 공간 상세한 모델을 사용 하는 방법을 지정 하는 개요 요약. 프로토콜의 현재 제한의 일부는 그들을 극복 하 고 더 심장 시스템 생물학에 세포 구조의 역할의 정량적 이해를 사전에 진행 되 고 새로운 개발 뿐만 아니라, 설명 되어 있습니다. 다른 세포 유형의 유한 요소 모델을 만들 이러한 메서드를 일반화 수 어떻게도 해결 됩니다.
이 프로토콜의 사용자 기존 전자 현미경 이미지 스택에 액세스할 경우 단계 1와 단계 2의 개조 부분 건너뛸 수 있습니다. 경험된 많은 전자 microscopists와 공동으로 그들의 데이터를 획득 하려는 사용자는 토론 하 고 고정 및 수집을 위한 최적의 프로토콜을 결정 하기 위해 전문가와 1 단계에서 착 절차를 비교 하실 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜 cardiomyocyte 열 대권 외의 기하학적 소설 유한 요소 모델을 생성 하는 주요 단계를 설명 합니다. 메서드 다른 현미경의 (또는, 원칙적으로, 다른 데이터) 계산 퓨전 modalities를 cardiomyocyte 역학 공간 셀 아키텍처의 세부 정보를 포함 하는 보다 포괄적인 전산 모델을 개발 하는 것을 수 있습니다. 현재는 cardiomyocyte의 같은 모델을 만드는 데 사용할 수 없습니다 다른 프로토콜이입니다.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 왕 사회의 뉴질랜드 마 즈 빠른 시작 그랜트 11-UOA-184, 인간 프론티어 과학 프로그램 연구 그랜트 RGP0027/2013와 오스트레일리아 연구 위원회 발견 프로젝트 교부 금 DP170101358에 의해 지원 되었다.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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