心筋細胞のシステム生物学における細胞構造の役割を研究する心筋細胞の構造的に現実的な有限要素の幾何学的なモデルを作成します。
Summary
このプロトコルでは、電子顕微鏡や共焦点顕微鏡画像から心筋細胞の細胞内構造の空間的有限要素モデルを作成する手法について説明します。カルシウム シグナルと生体エネルギー転換の事例を使用してこの空間詳細モデルの力を発揮します。
Abstract
電子線トモグラフィーなど三次元 (3 D) 画像処理技術の出現により、シリアル ブロック面走査電子顕微鏡と共焦点顕微鏡は、科学的なコミュニティは、大規模なデータセットへの前例のないアクセス サブミクロン建築改造を特徴づけるの解像度は、健康と病気心筋細胞機能の変化を伴います。ただし、これらのデータセットは、心筋細胞の機能細胞アーキテクチャの役割を調査するため利用されています。このプロトコルの目的は、高分解能電子顕微鏡と共焦点顕微鏡画像を用いた心筋細胞の高精度有限要素モデルを作成する方法の概要を説明することです。細胞アーキテクチャの詳細かつ正確なモデルには、心筋細胞生物学実験だけを集めることができます以上に新しい洞察力を提供するために重要な可能性があります。このメソッドの力は、計算上、心筋細胞の 1 つの統一された、詳細なモデルを開発する心筋細胞の微細構造の 2 つの異なる画像モダリティからの情報を融合する能力であります。このプロトコルは、電子線トモグラフィーと、心筋細胞の半筋節の有限要素モデルを開発する男性の大人の Wistar (白鼠の特定の品種の名前) ラット心筋細胞の共焦点顕微鏡画像を統合する手順をについて説明します。手順は正確、高解像度の描写を含む三次元有限要素モデルを生成する (〜 35 程度 nm) ミトコンドリア、筋原繊維と心筋細胞の必要なカルシウムを解放するリアノジン受容体クラスターの分布の筋原線維と細胞内コンパートメントに漿網状のネットワーク (SR) から収縮します。生成されたモデルとおりイラストが横行尿細管アーキテクチャまたは漿の網状のネットワークの詳細を取り入れていない、したがって、心筋細胞の最小モデル。それにもかかわらず、モデル既に適用できるカルシウム シグナル伝達とミトコンドリア生体エネルギー、示されていますと、次が表示されます 2 つの事例を用いて説明したセル構造の役割に基づくシミュレーション調査で、詳しいプロトコル。
Introduction
興奮収縮連関 (ECC) 中心部には、重要な複雑な心筋細胞膜の電気的興奮と各ハートビートの中にセルの後続の機械的収縮カップリングを指します。数理モデルは活動電位1,2、生体エネルギー3、ゾル性細胞質カルシウムを調節する連結された生化学的なプロセスの定量的理解の開発に重要な役割を果たしているとその後収縮力発生。このようなモデルは、1 つのハートビートの変更を予測しているも正常にまたはこれらの生化学的なプロセスのいくつかは変更4,5を受けます。心筋細胞の非常に組織の微細構造は、セルと心臓全体の正常な収縮機能に重要な役割を果たすにますます認識されています。確かに、肥大6心不全7、および糖尿病性心筋症8疾患の生化学の変化と並行して形態と心筋の微細構造のコンポーネントの構成の変更が発生します。これらの構造変化が変化しマイナー、適応、または病理学的応答かどうか生化学的な条件はまだ未知9です。生物の形と機能の間の本質的に密結合を意味する実験的研究だけでは構造を改造と心筋細胞の機能間の相関関係よりも深い洞察を提供できません。よく研究の生化学的なプロセスと、細胞内のコンポーネントの構造のアセンブリを組み込むことができる数理モデルの新世代の関係の定量的、総合的な理解を開発する必要が構造, 生物化学と心筋収縮力。このプロトコルでは、このような調査に使用することができます心筋細胞の構造的に高精度有限要素モデルの生成に使用できるメソッドについて説明します。
最後の十年は、3次元電子顕微鏡10、共焦点11、およびナノ ・ マイクロ スケールの組み立てに前例のない、高解像度の洞察力を提供する超解像顕微鏡12の重要な進歩を見ている、心筋細胞の細胞内コンポーネント。最近では、これらのデータセットは、心筋の微細構造13,14,15,16の計算モデルを生成する使用されています。これらのモデルでは、有限要素法17と呼ばれる確立されたエンジニア リング シミュレーション法を使用して、作成有限要素計算メッシュする生化学的なプロセスおよび心筋細胞の収縮をシミュレートできます。ただし、これらのモデルは解像度とディテール画像データセットに提供できる顕微鏡法によって制限されます。たとえば、電子顕微鏡は、セル構造のナノメートル レベルの詳細を生成できますが、モデルを作成する必要がありますイメージ内の特定の蛋白質を識別することは困難です。超解像光学顕微鏡で 50 程度の解像度で高コントラストな画像を提供できる一方でのみ、選択数分子コンポーネントのセルの nm。これら画像モダリティから補完的な情報を統合することによってのみすることができます 1 つ現実的に感度を調べる関数の構造の変化に。相関光学および電子顕微鏡はまだルーチンの手順と制限コンポーネント数が限られている可能性があります蛍光表示で染色、電子顕微鏡ビューと相関も苦しむことになります。
このプロトコルは、統計的手法19を使用して分析し、電子顕微鏡について他の心筋イオン チャネルの空間分布については光顕を融合計算手法18を提示します。筋原線維などミトコンドリアの微細構造コンポーネント。これは、心筋細胞の収縮を調節する生化学的なプロセスの心筋細胞内組織の役割を研究する生化学的なプロセスの生物物理のモデルで使用することができます有限要素モデルを生成します。たとえば、このプロトコルを使用してから健康的なモデルを作成できる、ストレプトゾトシン誘発糖尿病心筋細胞は糖尿病動物で観察される心筋細胞機能構造リフォームの効果を研究するモデル8。提案手法の統計的性質の付加的な利点はプロトコルにも示されている: メソッドは、セル構造の実験的に観察された変化を忠実に再現した有限要素のジオメトリの複数のインスタンスを生成することができます。
概要については、としてプロトコルの手順が含まれます: (i) 十分な解像度とコントラストの 3 D イメージを生成する電子顕微鏡検査のための心筋組織の準備(ii) 復興 3次元電子顕微鏡再構成および画像解析ソフトウェアを使用して電子顕微鏡データから 3 D 画像のスタックのセグメンテーションと呼ばれる IMOD20;(iii) iso2mesh21を使用して入力としてセグメントのデータを使用して有限要素メッシュを生成するには(iv) 新規アルゴリズムとコードを使用して、有限要素メッシュにイオン チャネルの分布をマップします。
各ステップへのアプローチの前提は、プロトコルに記載されている、代表的な結果は付属の数字で提供されます。生成された空間の詳細なモデルを使用するミトコンドリアバイオエナジェティックスと同様に、ECC、間にカルシウムの空間動態を勉強する方法を指定する概要を説明します。それらを克服し、さらに心臓システム生物学にセル構造の役割を定量的に理解を進める進められている新たな展開だけでなく、プロトコルの現在の制限のいくつか、説明します。他の細胞型の有限要素モデルを作成するこれらのメソッドを一般化する可能性がどのようにも解決されます。
このプロトコルのユーザーは、既存の電子顕微鏡画像のスタックへのアクセスを有すればステップ 1 とステップ 2 の復興の一部飛ばしてください。経験豊富な電子と共同で、データを取得しようとすると、ユーザーは、議論し、固定および汚損プロシージャ獲得のための最適なプロトコルを決定する専門家で手順 1 で比較するがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルでは、心筋細胞微細構造の新しい有限要素の幾何学的モデルを生成する重要な手順について説明します。メソッドにより空間細胞アーキテクチャの詳細を含む心筋細胞動態のより包括的な計算モデルを開発する各種の顕微鏡 (または、原則として、その他のデータ) 計算の融合療法です。現在では、心筋細胞のようなモデルの作成に利用可能な他のプロトコルはありません。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ロイヤル会のニュージーランド マースデン高速起動許可 11-UOA-184、人間フロンティア科学プログラム研究助成 2013 年 RGP0027 月とオーストラリアの研究評議会発見プロジェクトの助成金 DP170101358 によって支持されました。
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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