Создание Cardiomyocyte изучить роль сотовой архитектуры в биологии систем Cardiomyocyte геометрическая модель структурно реалистичные конечных элементов
Summary
Этот протокол описывает Роман метод для создания пространственно подробные конечно-элементной модели внутриклеточных архитектуры кардиомиоцитов из электронной микроскопии и confocal микроскопии изображений. Сила этой пространственно подробные модели показано с помощью тематических исследований в сигнализации кальция и биоэнергетика.
Abstract
С появлением трехмерных (3D) изображения технологии, такие как электронная томография серийный блок лицо сканирующей электронной микроскопии и конфокальная микроскопия, научное сообщество имеет беспрецедентный доступ к большим наборам данных в суб микрометра резолюции, которые характеризуют архитектурных ремоделирования, что сопровождает изменения в функции cardiomyocyte в здоровье и болезни. Однако эти наборы данных были использованы для изучения роли сотовой архитектуры ремоделирования cardiomyocyte функции. Целью настоящего Протокола является наметить способы создания точной конечно-элементной модели cardiomyocyte с помощью электронной микроскопии высокого разрешения и confocal микроскопии изображений. Подробную и точную модель сотовой архитектуры имеет значительный потенциал для обеспечить новое понимание cardiomyocyte биологии, больше, чем только эксперименты можно набрать. Сила этого метода заключается в его способности вычислительно предохранитель информацию от двух разнородных изображений условия ультраструктуры cardiomyocyte развивать одной единой и подробные модели cardiomyocyte. Этот протокол описывает шаги для интеграции электронная томография и confocal микроскопии изображений взрослых мужчин кардиомиоцитов крыс Wistar (имя для конкретной породы альбинос крысы) разработать половину Саркомер элементную модель cardiomyocyte. Процедура создает 3D элементную модель, содержащую точные, с высоким разрешением изображения (порядка ~ 35 Нм) распределения митохондрий, миофибрилл и рианодиновыми рецептор кластеры выпустить необходимые кальций для cardiomyocyte сокращение от sarcoplasmic ретикулярной сети (SR) в Миофибриллы и цитозольной отсек. Модель, созданная здесь, как иллюстрации не включать детали архитектуры поперечно трубочка или sarcoplasmic сети ретикулярные и поэтому является минимальным модель cardiomyocyte. Тем не менее, модель может применяться уже в на основе моделирования расследование роли клеточной структуры в сигнализации и митохондриальной Биоэнергетика кальция, который иллюстрируется и обсудили с помощью двух тематических исследований, которые представлены после подробный протокол.
Introduction
Муфта (ECC) возбуждения сокращение в самом сердце относится к важной и сложной муфты между электрического возбуждения cardiomyocyte мембраны и последующих механическое сокращение ячейки во время каждого сердцебиение. Математические модели играют ключевую роль в разработке количественных понимания взаимосвязанных биохимических процессов, которые регулируют потенциал действия1, цитозольной кальция, сигнализации2, биоэнергетика3и последующие поколение сократительной силы. Такие модели также успешно предсказал изменения пульса, когда один или несколько из этих биохимических процессов претерпевают изменения4,5. Все было признано высоко организованной Ультраструктура cardiomyocyte играть критически важную роль в нормальной сократительной функции клетки и всем сердцем. Действительно изменения морфологии и организации компонентов сердечной ультраструктуры происходят параллельно биохимические изменения в условиях заболевания как гипертрофия6, сердечной недостаточности7и8Диабетическая кардиомиопатия. Ли эти структурные изменения являются незначительными, адаптивной или патологических ответы на изменение биохимических условий по-прежнему во многом неизвестным9. По своей сути тесную связь между формой и функцией в биологии означает, что экспериментальные исследования самостоятельно не может обеспечить более глубокое понимание чем корреляции между структурной реконструкции и cardiomyocyte функции. Новое поколение математических моделей, которые могут включать структурные Ассамблея субклеточном компонентов, а также хорошо изучены биохимические процессы, являются необходимыми для разработки всеобъемлющей, количественное понимание взаимосвязи между структурой, биохимии и сократительной силы кардиомиоцитов. Этот протокол описывает методы, которые могут использоваться для создания структурно точных конечных элементов модели кардиомиоцитов, который может использоваться для таких расследований.
В последнее десятилетие наблюдается значительный прогресс в 3D электронной микроскопии10, конфокальная11и микроскопии суперразрешением12 , которые обеспечивают беспрецедентное, с высоким разрешением понимание нано- и микро масштабе Ассамблеи субклеточном компоненты cardiomyocyte. Недавно эти наборы данных были использованы для создания вычислительных моделей cardiomyocyte Ультраструктура13,14,,1516. Эти модели использовать налаженные инженерного моделирования метод, называемый метод конечных элементов17, для создания конечных элементов вычислительной сетки над какие биохимические процессы и cardiomyocyte схватки могут быть смоделированы. Однако эти модели ограничены резолюции и подробно, что микроскопии метод может предоставить в наборе данных изображения. К примеру электронной микроскопии может генерировать нанометрового уровня детализации структуры клеток, но это трудно определить специфических белков в пределах изображения, которые будут необходимы для создания модели. С другой стороны, супер резолюции оптической микроскопии могут обеспечить высокий контраст изображения с разрешением порядка 50 Нм только выбрать несколько молекулярных компонентов клетки. Только путем включения дополнительной информации от этих изображений форм можно один реально изучить чувствительность функции изменения в структуре. Корреляционные света и электронной микроскопии до сих пор не является обычной процедурой и она по-прежнему будет страдать ограничение что только ограниченное число компонентов могут витражи в представлении иммунофлюоресценции и коррелирует с видом электронной микроскопии.
Этот протокол представляет новый подход18 , которая использует19 статистические методы для анализа и вычислений предохранитель световой микроскопии информации на пространственное распределение каналов иона с электронной микроскопии информацию о других сердечных Ультраструктура компоненты, такие как миофибрилл и митохондрии. Это производит элементную модель, которая может использоваться с биофизические модели биохимических процессов для изучения роли cardiomyocyte субклеточном Организации на биохимические процессы, которые регулируют cardiomyocyte сужением. Например этот протокол может использоваться для создания моделей из здоровых и Стрептозотоцин индуцированной сахарным диабетом культивировании для изучения влияния структурной реконструкции на функции сердечной клетки, которая наблюдается в диабетической животных моделей8. Дополнительным преимуществом статистического характера представленных метода также иллюстрируется в протоколе: метод может генерировать несколько экземпляров конечных элементов геометрии, которые тесно имитировать экспериментально наблюдаемого изменения клеточной структуры.
Как обзор, протокол шаги включают: (i) подготовка сердечной ткани для электронной микроскопии для создания 3D изображения с достаточным разрешением и контрастностью; (ii) восстановления и сегментация 3D изображения стеков данных электронной микроскопии с помощью реконструкции 3D электронная микроскопия и анализ изображений программное обеспечение под названием IMOD20; (iii) использование iso2mesh21 для генерации сетки конечных элементов, используя сегментирована данные в качестве входных данных; (iv) использование Роман алгоритм и коды для картирования распределения ионных каналов на сетки конечных элементов.
Посылка подхода к каждый шаг описан в рамках протокола, и представитель результаты предоставляются в сопутствующих данных. Обзор приводится указание, как созданный пространственно подробные модели могут использоваться для изучения пространственной динамики кальция во время ECC, а также митохондриальной биоэнергетики. Обсуждаются некоторые из текущих ограничений протокола, а также новые события, которые идут по их преодолению и дальнейшего продвижения количественное понимание роли клеточной структуры к биологии сердечной системы. Рассматривается также как эти методы могут быть обобщены для создания модели конечных элементов других типов клеток.
Пользователи этого протокола может пропустить шаг 1 и реконструкции частью шаг 2, если они имеют доступ к ранее существовавших стек изображений электронной микроскопии. Пользователи, которые намерены приобретать их данных в сотрудничестве с более опытными microscopists электрон, возможно, пожелает обсудить и сравнить фиксации и окраски процедуры на шаге 1 с экспертом, чтобы определить оптимальный протокол для приобретения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вышеупомянутый Протокол описываются ключевые шаги для создания Роман элементного геометрическая модель ультраструктуры cardiomyocyte. Этот метод позволяет вычислительных слияние различных микроскопии (или, в принципе, другие данные) условия для разработки более всеобъемлющей модели вычи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Королевского общества Новой Зеландии Марсден быстро начать Грант 11-UOA-184, человека границ науки программы исследовательский грант RGP0027/2013 и Австралийский исследовательский совет обнаружения проекта Грант DP170101358.
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. – Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. – Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. . The finite element method. 1, (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. . Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
