Cardiomyocyte सिस्टंस जीवविज्ञान में सेलुलर वास्तुकला की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक Cardiomyocyte के एक संरचनात्मक यथार्थवादी परिमित तत्व ज्यामितीय मॉडल बनाना
Summary
इस प्रोटोकॉल एक उपंयास विधि की रूपरेखा को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों से cardiomyocytes के intracellular वास्तुकला का एक विशेष रूप से विस्तृत परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए । इस स्थानिक विस्तृत मॉडल की शक्ति कैल्शियम संकेतन और ऊर्जा के मामले में अध्ययन का उपयोग कर प्रदर्शन किया है ।
Abstract
तीन के आगमन के साथ आयामी (3 डी) ऐसे इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी, धारावाहिक के रूप में इमेजिंग प्रौद्योगिकियों-ब्लॉक-चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी, वैज्ञानिक समुदाय के उप में बड़े डेटासेट के लिए अभूतपूर्व पहुंच है-माइक्रोमीटर संकल्प है कि वास्तुकला remodeling है कि cardiomyocyte समारोह में स्वास्थ्य और रोग में परिवर्तन के साथ साथ विशेषताएं । हालांकि, इन डेटासेट के तहत किया गया है cardiomyocyte फ़ंक्शन में सेल्युलर आर्किटेक्चर remodeling की भूमिका की जांच के लिए उपयोग । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैसे उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग कर एक cardiomyocyte के एक सटीक परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए रूपरेखा है । सेलुलर वास्तुकला का एक विस्तृत और सटीक मॉडल cardiomyocyte जीव विज्ञान में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है, अकेले प्रयोगों से अधिक जुटाने कर सकते हैं । इस विधि की शक्ति अपने को अभिकलनी cardiomyocyte ultrastructure के दो असमान इमेजिंग विधियों से जानकारी के लिए एक एकीकृत और विस्तृत cardiomyocyte के मॉडल को विकसित करने की क्षमता में निहित है । इस प्रोटोकॉल कदम रूपरेखा के लिए इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और वयस्क पुरुष Wistar के फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों को एकीकृत (albino चूहा की एक विशिष्ट नस्ल के लिए नाम) चूहा cardiomyocytes के लिए एक आधा sarcomere परिमित तत्व cardiomyocyte के मॉडल का विकास । प्रक्रिया एक सटीक, उच्च संकल्प चित्रण (~ ३५ एनएम के आदेश पर) mitochondria, myofibrils और ryanodine रिसेप्टर क्लस्टर के वितरण की है कि cardiomyocyte के लिए आवश्यक कैल्शियम जारी एक 3 डी परिमित तत्व मॉडल उत्पंन करता है myofibril और cytosolic डिब्बे में sarcoplasmic जालीदार नेटवर्क (SR) से संकुचन । एक उदाहरण के रूप में यहां उत्पंन मॉडल अनुप्रस्थ-tubule वास्तुकला या sarcoplasmic जालीदार नेटवर्क के विवरण शामिल नहीं है और इसलिए cardiomyocyte की एक ंयूनतम मॉडल है । फिर भी, मॉडल पहले से ही अनुकरण में लागू किया जा सकता है आधारित जांच में कोशिका संरचना की भूमिका में कैल्शियम संकेतन और mitochondrial है, जो सचित्र है और दो मामलों के अध्ययन का उपयोग कर चर्चा की है कि निंनलिखित प्रस्तुत कर रहे है विस्तृत प्रोटोकॉल ।
Introduction
उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ECC) दिल में cardiomyocyte झिल्ली के विद्युत उत्तेजना और प्रत्येक दिल की धड़कन के दौरान सेल के बाद यांत्रिक संकुचन के बीच महत्वपूर्ण और जटिल युग्मन करने के लिए संदर्भित करता है । गणितीय मॉडल कड़ी जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का एक मात्रात्मक समझ विकसित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि कार्रवाई की क्षमता को विनियमित1, cytosolic कैल्शियम संकेतन2,3ऊर्जा, और बाद में सिकुड़ा बल पीढ़ी । इस तरह के मॉडल भी सफलतापूर्वक दिल की धड़कन में परिवर्तन की भविष्यवाणी की है जब एक या इन जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के कई परिवर्तन4,5से गुजरना । cardiomyocyte के अत्यधिक संगठित ultrastructure को तेजी से प्रकोष्ठ के सामान्य सिकुड़ा समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने और पूरे हृदय को मान्यता दी गई है. दरअसल, कार्डिएक ultrastructure के घटकों की आकृति विज्ञान और संगठन में परिवर्तन अतिवृद्धि6, हृदय विफलता7, और मधुमेह cardiomyopathy8के रूप में रोग की स्थिति में जैव रासायनिक परिवर्तन के समानांतर में होते हैं । क्या इन संरचनात्मक परिवर्तन मामूली, अनुकूली, या बदलते जैव रासायनिक स्थितियों के लिए रोग प्रतिक्रियाओं अभी भी काफी हद तक अज्ञात है9। स्वाभाविक रूप से तंग फार्म और जीव विज्ञान में समारोह के बीच युग्मन का मतलब है कि अकेले प्रयोगात्मक अध्ययन संरचनात्मक remodeling और cardiomyocyte समारोह के बीच सहसंबंध से गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सकते । गणितीय मॉडल है कि उप के संरचनात्मक विधानसभा-सेलुलर घटकों को शामिल कर सकते है की एक नई पीढ़ी, साथ अच्छी तरह से जैव रासायनिक प्रक्रियाओं का अध्ययन, के लिए एक व्यापक संबंध की मात्रात्मक समझ विकसित करने के लिए आवश्यक हैं cardiomyocytes में संरचना, जैव रसायन, और सिकुड़ा बल के बीच । इस प्रोटोकॉल विधियों कि cardiomyocytes के संरचनात्मक रूप से सटीक परिमित तत्व मॉडल है कि इस तरह की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पंन किया जा सकता का वर्णन ।
पिछले दशक 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी10, फोकल11, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी12 है कि नैनो में अभूतपूर्व, उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान पैमाने पर और सूक्ष्म पैमाने पर विधानसभा में महत्वपूर्ण प्रगति देखा है cardiomyocyte के उप सेलुलर घटकों । हाल ही में, इन datasets cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16की गणनात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया है । इन मॉडलों का उपयोग एक अच्छी तरह से स्थापित इंजीनियरिंग सिमुलेशन विधि, परिमित तत्व विधि17कहा जाता है, परिमित तत्व गणना जाल पर बनाने के लिए जो जैव रासायनिक प्रक्रियाओं और cardiomyocyte संकुचन नकली जा सकता है. हालांकि, ये मॉडल रिज़ॉल्यूशन और विस्तार द्वारा सीमित होते है जो एक माइक्रोस्कोपी पद्धति में छवि डेटासेट प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेल संरचना के नैनोमीटर स्तर का विस्तार उत्पन्न कर सकते हैं, लेकिन यह एक मॉडल बनाने के लिए आवश्यक होगा कि छवि के भीतर विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए मुश्किल है. दूसरी ओर, सुपर संकल्प ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी केवल एक चुनें सेल के कुछ आणविक घटकों के ५० एनएम के आदेश पर प्रस्तावों पर उच्च विपरीत चित्र प्रदान कर सकते हैं । केवल इन इमेजिंग विधियों से पूरक जानकारी को एकीकृत करके एक वास्तविक संरचना में परिवर्तन करने के लिए समारोह की संवेदनशीलता का पता लगाने कर सकते हैं । Correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अभी भी एक नियमित प्रक्रिया नहीं है और यह अभी भी है कि केवल घटकों की एक सीमित संख्या इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृश्य में दाग सकता है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी देखने के साथ संबंधित सीमा को भुगतना होगा ।
इस प्रोटोकॉल एक उपंयास दृष्टिकोण18 है कि सांख्यिकीय तरीके19 का उपयोग करता है विश्लेषण और गणना के लिए आयन के स्थानिक वितरण पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी जानकारी फ्यूज अंय हृदय पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जानकारी के साथ चैनलों ultrastructure घटक, जैसे myofibrils और mitochondria । यह एक परिमित तत्व मॉडल है कि जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के भौतिक मॉडल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं है कि cardiomyocyte संकुचन विनियमित पर cardiomyocyte उप सेलुलर संगठन की भूमिका का अध्ययन करने के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा करता है । उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के लिए स्वस्थ और streptozotocin प्रेरित मधुमेह कार्डियक myocytes से मॉडल बनाने के लिए कार्डियक सेल समारोह है कि मधुमेह पशु मॉडल में मनाया जाता है पर संरचनात्मक remodeling के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है8। प्रस्तुत विधि के सांख्यिकीय प्रकृति का एक अतिरिक्त लाभ भी प्रोटोकॉल में सचित्र है: विधि परिमित तत्व geometries के कई उदाहरण है कि बारीकी से सेल संरचना में मनाया बदलाव की नकल उत्पंन कर सकते हैं ।
एक सिंहावलोकन के रूप में, प्रोटोकॉल कदम में शामिल हैं: (i) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए पर्याप्त संकल्प और कंट्रास्ट के साथ 3 डी छवियों को उत्पन्न करने के लिए कार्डियक ऊतक की तैयारी; (ii) IMOD20नामक 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पुनर्निर्माण और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डेटा से 3 डी छवि स्टैक का पुनर्निर्माण और विभाजन; (iii) इनपुट के रूप में विभाजित डेटा का उपयोग कर एक परिमित तत्व मेष उत्पन्न करने के लिए iso2mesh21 का उपयोग करना; (iv) उपंयास एल्गोरिथ्म और कोड का उपयोग करने परिमित तत्व मेष पर आयन चैनलों के वितरण नक्शा ।
हर कदम के दृष्टिकोण के आधार प्रोटोकॉल के भीतर उल्लिखित है, और प्रतिनिधि परिणाम के साथ आंकड़े में प्रदान की जाती हैं । एक सिंहावलोकन निर्दिष्ट कैसे उत्पंन स्थानिक विस्तृत मॉडल ECC के दौरान कैल्शियम की स्थानिक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ mitochondrial । प्रोटोकॉल की वर्तमान सीमाओं के कुछ चर्चा कर रहे हैं, साथ ही साथ नए घटनाक्रम है कि उंहें दूर करने के लिए चल रहे है और आगे हृदय प्रणालियों जीव विज्ञान के लिए सेल संरचना की भूमिका का एक मात्रात्मक समझ अग्रिम । कैसे इन तरीकों को अंय प्रकार के सेल के परिमित तत्व मॉडल बनाने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है भी संबोधित किया है ।
इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ता चरण 1 और चरण 2 के पुनर्निर्माण भाग को छोड़ सकते है यदि वे एक पूर्व मौजूदा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि स्टैक करने के लिए उपयोग किया है । उपयोगकर्ता जो अधिक अनुभवी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सहयोग में अपने डेटा प्राप्त करने का इरादा चर्चा और निर्धारण और विशेषज्ञ के साथ चरण 1 में धुंधला प्रक्रियाओं के अधिग्रहण के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल निर्धारित करना चाहते हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल रूपरेखा महत्वपूर्ण कदम cardiomyocyte ultrastructure के एक उपंयास परिमित तत्व ज्यामितीय मॉडल उत्पंन करने के लिए । विधि विभिंन माइक्रोस्कोपी के अभिकलनी संलयन (या, सिद्धांत, अंय डेटा) में सक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम न्यूजीलैंड के रॉयल सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया मारसडेन डेवीड फास्ट स्टार्ट ग्रांट 11-UOA-१८४, द ह्यूमन फ्रंटियर्स साइंस प्रोग्राम रिसर्च ग्रांट RGP0027 2013 और ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट DP170101358 ।
Materials
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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