عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات
Summary
يوضح هذا المقال بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي وبناء مكتبة التسلسل الفائق من المواد دار النباتات بما في ذلك الإنقاذ من الحمض النووي استثنائية ذات النوعية الرديئة.
Abstract
العشبية مصدرا لا يقدر بثمن من المواد النباتية التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ويرتبط استخدام العينات دار النباتات مع عدد من التحديات بما في ذلك عينة الحفاظ على نوعية والحمض النووي المتدهورة والمدمرة لأخذ العينات من عينات نادرة. من أجل استخدام أكثر فعالية المواد دار النباتات في المشاريع الكبيرة التسلسل، هناك حاجة إلى طريقة يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتطوير لإعداد مكتبة وعزل الحمض النووي. وتبين هذه الورقة بروتوكول قوية، وبداية لنهاية للحمض النووي والعزلة والفائق مكتبة البناء من عينات دار النباتات التي لا تحتاج إلى تعديل لعينات الأفراد. هذا البروتوكول مصمم خصيصا لتدني نوعية المجفف مصنع المواد وتحيط الاستفادة من الأساليب القائمة عن طريق تحسين طحن الأنسجة وتعديل التحديد حجم المكتبة، وإدخال خطوة ريمبليفيكيشن اختياري لمكتبات منخفضة الغلة. ريمبليفيكيشن مكتبات الحمض النووي منخفضة الغلة يمكن إنقاذ العينات المستمدة من عينات دار النباتات لا يمكن الاستغناء عنه، ويحتمل أن تكون قيمة، يلغي الحاجة إلى أخذ العينات الإضافية المدمرة ودون إدخال التحيز تسلسل واضح للمشترك تطبيقات النشوء والتطور. البروتوكول قد تم اختباره على مئات الأنواع العشب، ولكن من المتوقع أن تكون قابلة للتكيف للاستخدام في السلالات النباتية الأخرى بعد التحقق. هذا البروتوكول يمكن أن تكون محدودة بالحمض النووي المتدهورة جداً، حيث لا توجد شظايا في نطاق الحجم المطلوب، ونواتج الأيض الثانوية الموجودة في بعض المواد النباتية التي تحول دون عزل الحمض النووي نظيفة. وعموما، يدخل هذا البروتوكول طريقة سريعة وشاملة تسمح بعزل الحمض النووي وإعداد مكتبة العينات 24 في أقل من 13 h, مع فقط 8 ح وقت العملي النشط مع الحد الأدنى من التعديلات.
Introduction
مجموعات دار النباتات مصدر يحتمل أن تكون قيمة الأنواع والتنوع الجينومي للدراسات بما في ذلك السلالات1،2،3،4،علم الوراثة السكانية5، الحفظ علم الأحياء6والأنواع الغازية البيولوجيا7سمة تطور8. ويسلط الضوء على إمكانية الحصول على مجموعة متنوعة غنية من الأنواع، والسكان، والمواقع الجغرافية، والنقاط الزمنية “الكنز”9 هو دار النباتات. تاريخيا، طبيعة الحمض النووي المستمدة من دار النباتات المتدهورة قد أعاق المشاريع المستندة إلى بكر، محيلة الباحثين غالباً باستخدام علامات فقط وجدت في نسخة عالية، مثل مناطق الجينوم بلاستيدات الخضراء أو مباعدة يدون الداخلية (البحث عن) ريبوسومال الجيش الملكي النيبالي. نوعية العينات والحمض النووي تختلف على نطاق واسع على أساليب المحافظة على9،10، مع فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل وتجزئة من الحرارة المستخدمة في عملية التجفيف يجري الأشكال الأكثر شيوعاً من الأضرار، وخلق ما يسمى 90% الحمض النووي إقفال التي قد شغلت الدراسات المستندة إلى بكر11. وبصرف النظر عن التجزؤ، المسألة الثانية الأكثر انتشارا في دار النباتات علم الجينوم هو التلوث، مثل التي تستمد من الفطريات اندوفيتيك13 أو الفطريات المكتسبة بعد الوفاة بعد جمع ولكن قبل تصاعد في دار النباتات12، على الرغم هذه المشكلة يمكن حلها بيوينفورماتيكالي نظراً لقاعدة حق فطري (انظر أدناه). مشكلة الثالثة، وأقل شيوعاً، تعديل تسلسل عن طريق السيتوزين deamination (C/G→T/A)14، على الرغم من أنه يقدر أن تكون منخفضة (~ 0.03 ٪) في دار النباتات العينات11. مع ظهور التسلسل الفائق (HTS)، يمكن التغلب على مسألة التجزؤ مع القراءات قصيرة وتسلسل عمق12،15، مما يتيح الحصول على البيانات الجينومية مستوى من عينات عديدة ذات جودة منخفضة الحمض النووي، وحتى في بعض الأحيان السماح تسلسل الجينوم كله15.
أصبحت أكثر كثيرا ما تستخدم عينات دار النباتات وهي من أكبر مكونات المشاريع النشوء والتطور16. تحدي الحالي لاستخدام العينات دار النباتات ل HTS هو استمرار الحصول على كافية مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، شرطا لازما لتسلسل البروتوكولات، من العديد من الأنواع في الوقت المناسب، دون الحاجة إلى تحسين أساليب للفرد العينات. في هذه الورقة، هو أثبت بروتوكول لاستخراج الحمض النووي وإعداد مكتبة دار النباتات عينات من أن يستفيد من الأساليب القائمة، وتقوم بتعديلها للسماح لنتائج سريعة وقابلة للتكرار. يسمح هذا الأسلوب لإكمال تجهيز من العينة إلى مكتبة عينات 24 في ح 13، مع وقت التدريب العملي على ح 8، أو ح 16، مع مرور الوقت العملي ح 9، عندما يكون مطلوباً الخطوة ريمبليفيكيشن الاختياري. المعالجة المتزامنة للمزيد من نماذج قابلة للتحقيق، على الرغم من عاملاً يحد من قدرة أجهزة الطرد المركزي، والمهارات التقنية. البروتوكول يهدف إلى تتطلب فقط نموذجي معدات المختبرات (ثيرموسيكلير وأجهزة الطرد المركزي، وتقف المغناطيسية) بدلاً من المعدات المتخصصة، مثل البخاخات أو سونيكاتور، أو لقص الحمض النووي.
نوعية الحمض النووي وحجم الشظايا والكمية تحد من عوامل لاستخدام العينات دار النباتات في تجارب التسلسل الفائق. وسائل أخرى لعزل الحمض النووي دار النباتات وإنشاء مكتبات التسلسل الفائق أثبتت جدوى استخدام أقل من 10 نانوغرام من16من الحمض النووي؛ إلا أنها تتطلب تجريبيا تحديد العدد الأمثل من بكر دورات اللازمة لإعداد المكتبة. يصبح هذا غير عملي عند التعامل مع كميات صغيرة للغاية من مزدوجة قابلة للحياة تقطعت الحمض النووي (dsDNA)، كما تنتج بعض العينات دار النباتات إلا ما يكفي الحمض النووي لإعداد مكتبة واحدة. يستخدم الأسلوب المقدمة هنا عدد واحد من الدورات بغض النظر عن نوعية العينة، حيث يتم فقدان لا الحمض النووي في مكتبة الأمثل الخطوات. بدلاً من ذلك، يتم استدعاء خطوة ريمبليفيكيشن عند المكتبات لا تفي الحد الأدنى من المبالغ اللازمة للتسلسل. العديد من دار النباتات عينات نادرة وحيازة المواد قليلة مما يجعل من الصعب تبرير أخذ العينات المدمرة في كثير من الحالات. ولمواجهة ذلك، يسمح البروتوكول المقدم دسدنا إدخال أحجام أقل من 1.25 نغ في عملية إعداد مكتبة، وتوسيع نطاق نماذج قابلة للتطبيق للتسلسل الفائق، والتقليل من الحاجة إلى أخذ العينات المدمرة للعينات.
وقد الأمثل للأعشاب البروتوكول التالي واختبارها على مئات أنواع المختلفة من عينات دار النباتات، على الرغم من أننا نتوقع أن البروتوكول يمكن أن تطبق على العديد من المجموعات النباتية الأخرى. وهو يشمل خطوة انتعاش اختيارية التي يمكن استخدامها لتوفير جودة منخفضة و/أو عينات نادرة. استناداً إلى ما يزيد على مائتي دار النباتات عينات اختبار، يعمل هذا البروتوكول على العينات مع إدخال الأنسجة منخفضة ونوعية، مما يسمح للحفاظ على عينات نادرة من خلال أخذ العينات المدمرة الحد الأدنى. ويتضح هنا أن هذا البروتوكول يمكن أن توفر مكتبات ذات جودة عالية والتي يمكن أن تكون متسلسلة للمشاريع المستندة إلى فيلوجينوميكس.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروضة هنا طريقة شاملة وقوية لعزل الحمض النووي وتسلسل إعداد مكتبة من العينات النباتية المجففة. تناسق الأسلوب والحد الأدنى من الحاجة إلى تغيير على أساس جعل نوعية العينة أنها قابلة للتطوير للمشاريع الكبيرة التسلسل القائم على دار النباتات. إدراج خطوة ريمبليفيكيشن الاختياري ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر تايلور أوبوتشون-الأكبر، تيشير الأردن، وزودوك كريستينا للمساعدة في جمع العينات العينات دار النباتات، وحديقة ميسوري للنباتات للحصول على عينات من دار النباتات لأخذ العينات المدمرة. وكان هذا العمل الدعم بمنحه من “مؤسسة العلوم الوطنية” (ديب-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
