वानस्पतिक नमूनों के लिए मजबूत डीएनए अलगाव और उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण
Summary
यह आलेख डीएनए अलगाव और असाधारण खराब गुणवत्ता वाले डीएनए के बचाव सहित वानस्पतिक सामग्री से उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालय निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है ।
Abstract
Herbaria संयंत्र सामग्री है कि जैविक अध्ययन की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अमूल्य स्रोत हैं । वानस्पतिक नमूनों का उपयोग नमूना संरक्षण की गुणवत्ता, अपमानित डीएनए, और दुर्लभ नमूनों की विनाशकारी नमूना सहित चुनौतियों के एक नंबर के साथ जुड़ा हुआ है । आदेश में और अधिक प्रभावी ढंग से बड़ी अनुक्रमण परियोजनाओं में वानस्पतिक सामग्री का उपयोग करने के लिए, डीएनए अलगाव और पुस्तकालय की तैयारी के एक भरोसेमंद और स्केलेबल विधि की जरूरत है । इस कागज एक मजबूत, डीएनए अलगाव और उच्च प्रवाह वानस्पतिक नमूनों कि व्यक्तिगत नमूनों के लिए संशोधन की आवश्यकता नहीं है से पुस्तकालय निर्माण के लिए अंत प्रोटोकॉल को दर्शाता है । इस प्रोटोकॉल कम गुणवत्ता संयंत्र सामग्री के लिए सिलवाया है और ऊतक पीसने के अनुकूलन के द्वारा मौजूदा तरीकों का लाभ लेता है, पुस्तकालय आकार चयन को संशोधित करने, और कम उपज पुस्तकालयों के लिए एक वैकल्पिक पुनर्वर्धन कदम शुरू । कम उपज डीएनए पुस्तकालयों के पुनर्वर्धन अपूरणीय और संभावित मूल्यवान वानस्पतिक नमूनों से व्युत्पंन नमूने, अतिरिक्त विनाशकारी नमूने की आवश्यकता को नकारने और आम के लिए प्रत्यक्ष अनुक्रमण पूर्वाग्रह शुरू करने के बिना बचाव कर सकते हैं वंशावली अनुप्रयोगों । प्रोटोकॉल घास प्रजातियों के सैकड़ों पर परीक्षण किया गया है, लेकिन सत्यापन के बाद अन्य संयंत्र वंश में उपयोग के लिए अनुकूलनीय होने की उम्मीद है. इस प्रोटोकॉल अत्यंत अपमानित डीएनए, जहां टुकड़े वांछित आकार सीमा में मौजूद नहीं है द्वारा सीमित किया जा सकता है, और माध्यमिक चयापचयों कुछ संयंत्र सामग्री में मौजूद है कि स्वच्छ डीएनए अलगाव को बाधित । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का परिचय एक तेज और व्यापक विधि है कि डीएनए अलगाव और 24 नमूनों के पुस्तकालय की तैयारी के लिए अनुमति देता है से कम 13 ज, सक्रिय हाथों के केवल 8 एच के साथ समय पर ंयूनतम संशोधनों के साथ ।
Introduction
वानस्पतिक संग्रह दोनों प्रजातियों और जीनोमिक phylogenetics1,2,3, जनसंख्या आनुवंशिकी4,5, संरक्षण सहित अध्ययन के लिए विविधता का एक संभावित मूल्यवान स्रोत हैं जीव विज्ञान6, इनवेसिव प्रजातियों जीव विज्ञान7, और विशेषता विकास8। प्रजातियों, आबादी, भौगोलिक स्थानों की एक समृद्ध विविधता प्राप्त करने की क्षमता, और समय अंक “खजाना सीने”9 कि वानस्पतिक है पर प्रकाश डाला गया । ऐतिहासिक, वानस्पतिक-प्राप्त डीएनए की विकृत प्रकृति पीसीआर आधारित परियोजनाओं में बाधा है, अक्सर केवल उच्च प्रतिलिपि में पाया मार्करों का उपयोग करने के लिए शोधकर्ताओं माफिक, जैसे chloroplast जीनोम या आंतरिक लिखित स्पेसर (इसके) के क्षेत्रों के रूप में राइबोसोमल आरएनए. नमूनों और डीएनए की गुणवत्ता बड़े पैमाने पर9संरक्षण के तरीकों के आधार पर,10, डबल-फंसे टूट जाता है और सुखाने की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया गर्मी से विखंडन के साथ हानि का सबसे आम रूपों जा रहा है, बनाने तथाकथित 90% डीएनए लॉक अप कि भारग्रस्त है पीसीआर आधारित अध्ययन11। विखंडन के अलावा, वानस्पतिक जीनोमिक्स में दूसरा सबसे प्रचलित मुद्दा दूषित है, जैसे कि endophytic कवक से व्युत्पंन13 या कवक संग्रह के बाद गुजाइश का अधिग्रहण किया, लेकिन वानस्पतिक12में बढ़ते पहले, हालांकि इस समस्या को हल किया जा सकता है bioinformatically सही कवक डेटाबेस दिया (नीचे देखें) । एक तिहाई, और कम आम, समस्या cytosine के माध्यम से अनुक्रम संशोधन है (सी/जी → T/ए)14, हालांकि यह कम होने का अनुमान है (~ 0.03%) वानस्पतिक नमूनों में11। उच्च प्रवाह अनुक्रमण (HTS) के आगमन के साथ, विखंडन का मुद्दा कम पढ़ता है और अनुक्रमण गहराई12,15, कम गुणवत्ता के साथ कई नमूनों से जीनोमिक स्तर के डेटा अधिग्रहण की अनुमति के साथ दूर किया जा सकता डीएनए, और यहां तक कि कई बार15पूरे जीनोम अनुक्रमण की अनुमति ।
वानस्पतिक नमूने और अक्सर इस्तेमाल किया जा रहे है और वंशावली परियोजनाओं के एक बड़े घटक है16। HTS के लिए वानस्पतिक नमूनों का उपयोग कर के एक मौजूदा चुनौती लगातार पर्याप्त डबल फंसे डीएनए, अनुक्रमण प्रोटोकॉल के लिए एक आवश्यक शर्त, एक समय पर तरीके से कई प्रजातियों से, व्यक्ति के लिए तरीकों का अनुकूलन करने की जरूरत के बिना प्राप्त है नमूनों. इस पत्र में, डीएनए निष्कर्षण और वानस्पतिक नमूनों की पुस्तकालय तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है कि मौजूदा तरीकों का लाभ लेता है और उंहें संशोधित करने के लिए तेजी से और replicable परिणामों के लिए अनुमति देते हैं । यह विधि नमूना से पूरा प्रसंस्करण के लिए 13 घंटे में 24 नमूनों की एक पुस्तकालय के लिए अनुमति देता है, 8 घंटे के साथ समय पर, या 16 एच, के साथ 9 ज हाथ समय पर, जब वैकल्पिक पुनर्वर्धन कदम की आवश्यकता है । अधिक नमूनों की एक साथ प्रसंस्करण प्राप्त है, हालांकि सीमित कारक क्षमता और तकनीकी कौशल केंद्रापसारक है । प्रोटोकॉल के लिए केवल विशिष्ट प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है (thermocycler, केंद्रापसारक, और चुंबकीय खड़ा है) के बजाय विशेष उपकरण, जैसे एक छिटकानेवाला या sonicator, बाल काटना डीएनए के लिए के लिए डिज़ाइन किया गया है ।
डीएनए गुणवत्ता, टुकड़ा आकार, और मात्रा उच्च प्रवाह अनुक्रमण प्रयोगों में वानस्पतिक नमूनों के उपयोग के लिए कारक सीमित कर रहे हैं । वानस्पतिक डीएनए को अलग करने और उच्च प्रवाह अनुक्रमण पुस्तकालयों बनाने के लिए अन्य तरीकों के रूप में कम के रूप में 10 डीएनए के एनजी का उपयोग करने की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है16; लेकिन वे प्रयोग कर पीसीआर पुस्तकालय की तैयारी के लिए आवश्यक चक्र के इष्टतम संख्या निर्धारित की आवश्यकता है । यह अव्यावहारिक हो जाता है जब व्यवहार्य डबल असहाय डीएनए (dsDNA) की बेहद छोटी मात्रा के साथ काम, के रूप में कुछ वानस्पतिक नमूनों एक पुस्तकालय की तैयारी के लिए केवल पर्याप्त डीएनए का उत्पादन । यहां प्रस्तुत विधि नमूना गुणवत्ता की परवाह किए बिना चक्रों की एक संख्या का उपयोग करता है, तो कोई डीएनए पुस्तकालय अनुकूलन चरणों में खो दिया है । जब लायब्रेरीज़ sequencing के लिए आवश्यक ंयूनतम मात्रा को पूरा नहीं इसके बजाय, एक पुनर्वर्धन चरण लाया है । कई वानस्पतिक नमूने दुर्लभ है और यह मुश्किल कई मामलों में विनाशकारी नमूने का औचित्य साबित करने के लिए बनाने के लिए थोड़ा सामग्री के अधिकारी । इस काउंटर करने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल की अनुमति देता है dsDNA इनपुट आकार से कम 1.25 पुस्तकालय तैयार करने की प्रक्रिया में एनजी, उच्च प्रवाह अनुक्रमण के लिए व्यवहार्य नमूनों की गुंजाइश का विस्तार और नमूनों की विनाशकारी नमूना लेने की आवश्यकता को कम करने ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल घास के लिए अनुकूलित और वानस्पतिक नमूनों से विभिंन प्रजातियों के सैकड़ों पर परीक्षण किया गया है, हालांकि हम उंमीद है कि प्रोटोकॉल कई अंय संयंत्र समूहों के लिए लागू किया जा सकता है । यह कम गुणवत्ता और/या दुर्लभ नमूनों को बचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक वैकल्पिक वसूली कदम भी शामिल है । के आधार पर २०० वानस्पतिक नमूनों का परीक्षण किया, इस प्रोटोकॉल कम ऊतक इनपुट और गुणवत्ता के साथ नमूनों पर काम करता है, ंयूनतम विनाशकारी नमूना के माध्यम से दुर्लभ नमूनों के संरक्षण के लिए अनुमति देता है । यहां यह पता चला है कि इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता पुस्तकालयों कि phylogenomics आधारित परियोजनाओं के लिए अनुक्रम किया जा सकता प्रदान कर सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत डीएनए अलगाव और अनुक्रमण सूखे संयंत्र नमूनों से पुस्तकालय की तैयारी के लिए एक व्यापक और मजबूत तरीका है । विधि की निरंतरता और इसे बदलने के लिए ंयूनतम जरूरत नमूना गुणवत्ता के आधा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम टेलर AuBuchon-एल्डर, जॉर्डन Teisher, और क्रिस्टीना Zudock नमूना वानस्पतिक नमूनों में सहायता के लिए धंयवाद, और मिसौरी के लिए विनाशकारी नमूने के लिए वानस्पतिक नमूनों का उपयोग करने के लिए वनस्पति उद्यान । यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (देब-१४५७७४८) से एक अनुदान द्वारा समर्थन किया गया ।
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
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