Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier
Summary
Cet article illustre un protocole détaillé pour l’isolement de l’ADN et construction de bibliothèque de séquençage haut-débit de matériel d’herbier dont le sauvetage de l’ADN de très mauvaise qualité.
Abstract
Les herbiers sont une source inestimable de matériel végétal qui peut être utilisé dans une variété d’études biologiques. L’utilisation de spécimens d’herbier est associé liée un certain nombre de défis, y compris la qualité de conservation des échantillons ADN dégradé et échantillonnage destructif des spécimens rares. Afin d’utiliser plus efficacement le matériel d’herbier dans les projets de séquençage de grand, il faut une méthode fiable et évolutive de préparation d’ADN d’isolement et de la bibliothèque. Cet article démontre un protocole robuste, début à la fin pour ADN isolement et haut débit bibliothèque construction de spécimens d’herbier qui ne nécessite pas de modification pour des échantillons individuels. Ce protocole est adapté pour la plante basse qualité séchée matériel et prend l’avantage des méthodes existantes en optimisant les tissus meulage, modification de sélection de la taille de bibliothèque et en introduisant une étape facultative de reamplification pour les bibliothèques de faible rendement. Reamplification de bibliothèques d’ADN avec un faible rendement peut sauver des échantillons provenant de spécimens d’herbier potentiellement précieux et irremplaçable, niant la nécessité pour un échantillonnage destructeur additionnel et sans introduire un biais de séquençage discernable pour common applications de la phylogénétiques. Le protocole a été testé sur des centaines d’espèces de graminées, mais devrait être adaptable pour utilisation dans les autres lignées de plantes après vérification. Ce protocole peut être limité par l’ADN extrêmement dégradé, où des fragments n’existent pas dans la gamme de taille désirée, et de métabolites secondaires présents dans une substance végétale qui inhibent l’isolement d’ADN propre. Dans l’ensemble, ce protocole présente une méthode complète et rapide qui permet l’isolement d’ADN et préparation de la bibliothèque des 24 échantillons en moins de 13 h, avec seulement 8 h de la période de pratique active avec des modifications minimes.
Introduction
Collections de l’herbier sont une source potentiellement utile des deux espèces et la diversité génomique d’études y compris phylogénétique1,2,3, génétique des populations,4,5, conservation biologie6espèces envahissantes biologie7et trait evolution8. La possibilité d’obtenir une riche diversité d’espèces, populations, lieux géographiques et points dans le temps met en lumière le « treasure chest »9 qui est de l’herbier. Historiquement, la nature dégradée de l’ADN dérivé herbier a entravé les projets axés sur la PCR, reléguant souvent les chercheurs à utiliser uniquement les marqueurs trouvés à élevé de copies, comme les régions du génome chloroplastique ou l’espaceur interne transcrit (ITS) de le ribosomique ARN. Qualité des spécimens et ADN varient largement basé sur les méthodes de préservation9,10, avec des cassures double-brin et la fragmentation de la chaleur utilisée dans le processus de séchage étant les formes les plus courantes des dommages, la création du ce que l’on appelle 90 % ADN de lock-up qui a grevé les études basées sur la PCR11. En dehors de la fragmentation, deuxième plus répandu en génomique de l’herbier s’agit de contamination, telles que cette dérivée de champignons endophytes13 ou champignons acquis post mortem après la collecte mais avant de monter dans l’herbier12, bien que ce problème peut être résolu bioinformatically compte tenu de la base de données droit fongique (voir ci-dessous). Un troisième problème, moins fréquents, est la modification de séquence par le biais de cytosine désamination (C/G→T/A)14, bien qu’on estime être faible (~ 0,03 %) à l’herbier spécimens11. Avec l’avènement de séquençage haut débit (HTS), la question de la fragmentation peut être surmontée avec quelques lectures et séquençage profondeur12,15, permettant l’acquisition des données génomiques des nombreux spécimens de faible qualité L’ADN et parfois même permettre de séquençage du génome entier15.
Des échantillons d’herbier sont devenant plus fréquemment utilisés et sont une plus grande partie des projets phylogénétique16. Un défi actuel de l’utilisation de spécimens d’herbier pour HTS est systématiquement obtenir suffisamment ADN bicaténaire, indispensable pour les protocoles de séquençage, de nombreuses espèces dans un délai raisonnable, sans avoir besoin d’optimiser des méthodes pour l’individu spécimens. Dans cet article, un protocole d’extraction d’ADN et préparation de la bibliothèque de spécimens d’herbier démontre qui tire profit des méthodes existantes et modifie leur permettant des résultats rapides et reproductibles. Cette méthode permet complète transformation du spécimen dans une bibliothèque de 24 échantillons à 13 h, avec temps de pratique 8 h, ou 16 h, avec le temps de pratique 9 h, quand l’étape facultative reamplification est nécessaire. Traitement simultané de plusieurs échantillons est réalisable, même si le facteur limitant est la capacité de centrifugeuse et de compétences techniques. Le protocole vise à exiger uniquement matériel de laboratoire typique (thermocycleur, centrifugeuse et supports magnétiques) au lieu de l’équipement spécialisé, comme un nébuliseur ou un sonicateur, pour la tonte de l’ADN.
Qualité de l’ADN, taille du fragment et la quantité sont des facteurs d’utilisation des spécimens d’herbier dans les expériences de séquençage haut débit limitant. Autres méthodes pour isoler l’ADN de l’herbier et création de bibliothèques de séquençage haut débit ont démontré l’utilité d’utiliser aussi peu que 10 ng d’ADN16; Cependant ils ont besoin de déterminer expérimentalement le nombre optimal de PCR cycles requis pour la préparation de la bibliothèque. Cela devient impraticable lorsque traitant de très petites quantités de double viable stranded DNA (ADN double brin), car certains spécimens d’herbier produisent seulement assez ADN pour une préparation de bibliothèque unique. La méthode présentée ici utilise un numéro unique de cycles indépendamment de la qualité de l’échantillon, donc aucun ADN ne se perd dans les étapes d’optimisation de bibliothèque. Au lieu de cela, une étape de reamplification est appelée lorsque les bibliothèques ne respectent pas les montants minimums nécessaires pour l’ordonnancement. De nombreux échantillons d’herbier sont rares et possèdent peu de matériel rendant difficile de justifier l’échantillonnage destructeur dans de nombreux cas. Pour contrer cela, le protocole présenté permet de dsDNA entrée tailles moins de 1,25 ng dans le processus de préparation de bibliothèque, élargit la portée des échantillons viables pour haut débit séquençage et réduisant au minimum la nécessité d’échantillonnage destructeur des spécimens.
Le protocole suivant a été optimisé pour les graminées et testé sur des centaines d’espèces différentes des échantillons d’herbier, même si nous attendons que le protocole peut être appliqué à beaucoup d’autres groupes de plantes. Il comprend une étape de récupération en option qui peut être utilisée pour enregistrer la basse qualité et/ou des spécimens rares. Après plus de deux cents spécimens d’herbier testés, ce protocole fonctionne sur des spécimens avec faible tissu d’entrée et de qualité, permettant la préservation des spécimens rares par échantillonnage destructeur minime. Ici, il est démontré que ce protocole peut fournir des bibliothèques de haute qualité qui peuvent être séquencés pour projets axés sur la phylogénomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici est une méthode complète et robuste pour l’isolement de l’ADN et le séquençage de préparation de la bibliothèque de spécimens de plantes séchées. La cohérence de la méthode et de la nécessité minimale de l’altérer basé sur spécimen qualité fais il évolutive pour les projets de grand séquençage axée sur l’herbier. L’inclusion d’une étape de reamplification en option pour les bibliothèques de faible rendement permet l’inclusion de basse qualité, faible quant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Taylor AuBuchon-Elder, Jordan Teisher et Kristina Zudock d’assistance dans les herbiers d’échantillonnage et le jardin botanique du Missouri pour l’accès aux spécimens d’herbier pour échantillonnage destructeur. Ce travail a été prise en charge par une subvention de la Fondation nationale des sciences (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
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