Robust DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek konstruktion til Herbarium prøver
Summary
Denne artikel viser en detaljeret protokol for DNA isoleret og høj overførselshastighed sekventering bibliotek byggeri fra herbarium materiale herunder redning af usædvanligt dårlige DNA.
Abstract
Herbarier er en uvurderlig kilde af plantemateriale, der kan bruges i en bred vifte af biologiske undersøgelser. Brugen af herbarium enheder er forbundet med en række udfordringer, herunder prøve bevarelse kvalitet, forringet DNA og destruktiv prøvetagning af sjældne eksemplarer. Mere effektivt bruge herbarium materiale i store sekventering projekter, der er behov for en pålidelig og skalerbar fremstillingsmetoden DNA isolation og bibliotek. Dette papir viser en robust, start-til-slut protokol for DNA isoleret og høj overførselshastighed bibliotek byggeri fra herbarium enheder der ikke kræver ændring for individuelle prøver. Denne protokol er skræddersyet til lav kvalitet tørret plante materiale og tager fordel af eksisterende metoder ved at optimere væv slibning, ændre bibliotek størrelse udvælgelse og indføre en valgfri reamplification skridt for lavt udbytte biblioteker. Reamplification af lavt udbytte DNA biblioteker kan redde prøver afledt af uerstattelige og potentielt værdifulde herbarium prøver, bevirke, at behovet for yderligere destruktiv prøvetagning og uden at indføre mærkbar sekventering bias for fælles Fylogenetisk applikationer. Protokollen er blevet testet på hundredvis af græs arter, men forventes at kunne tilpasses til brug i andre plante lineages efter verifikation. Denne protokol kan begrænses ved meget forringet DNA, hvor fragmenter ikke findes i den ønskede størrelsesområde, og sekundære metabolitter til stede i nogle plantemateriale, der hæmmer ren DNA isolation. Samlet set indfører denne protokol en hurtig og omfattende metode, der giver mulighed for DNA isolation og bibliotek forberedelse af 24 prøver i mindre end 13 h, med kun 8 h aktive hands-on tid med minimale ændringer.
Introduction
Herbarium samlinger er en potentielt værdifulde kilde til både arter og genomisk mangfoldighed for undersøgelser, herunder phylogenetics1,2,3, populationsgenetik4,5, bevarelse biologi6, invasive arters biologi7og træk evolution8. Evnen til at opnå en rig mangfoldighed af arter, populationer, geografiske steder og tidspunkter fremhæver “skattekiste”9 , som er herbarium. Historisk set har har den forringede karakter af herbarium-afledte DNA hindret PCR-baserede projekter, ofte relegating forskere til at bruge kun markører fundet i høj kopi, såsom regioner i grønkornets genom eller den interne transskriberede spacer (ITS) i de ribosomale RNA. Kvaliteten af prøver og DNA variere udstrakt grad baseret på metoder til bevarelse9,10, med dobbelt-strenget pauser og opsplitning fra varmen bruges i tørringsprocessen er de mest almindelige former for skader, skaber den såkaldte 90% DNA lock-up, der har belastet PCR-baserede studier11. Bortset fra fragmentering er den anden mest udbredte problem i herbarium genomforskning forurening, der stammer fra endophytic svampe13 eller svampe erhvervet postmortem efter samling men før montering i herbarium12, selv Dette problem kan blive løst bioinformatically givet den lige svampe database (se nedenfor). En tredje og mindre almindelige, problemet er sekvens ændring gennem cytosin deamination (C/G→T/A)14, selvom det skønnes for at være lavt (~ 0,03%) i herbarium prøver11. Med fremkomsten af høj overførselshastighed sekventering (HTS), kan spørgsmålet om opsplitning overvindes med kort læser og sekventering dybde12,15, tillader genomisk-niveau dataopsamling fra talrige prøver med lav kvalitet DNA, og nogle gange endda tillade hele genome sequencing15.
Herbarium prøver at blive hyppigere anvendes og er en større komponent om fylogenetiske projekter16. En nuværende udfordring ved at bruge herbarium prøver for HTS konsekvent opnå tilstrækkelig dobbelt strandede DNA, en nødvendig forudsætning for sekventering protokoller, fra talrige arter i tide, uden at behøve at optimere metoder for enkelte prøver. I dette papir, er en protokol til DNA-ekstraktion og bibliotek præparation af herbarium prøver viste der udnytter eksisterende metoder og ændrer dem til at give mulighed for hurtig og reproducerbare resultater. Denne metode giver mulighed for komplet behandling fra prøvemateriale til et bibliotek med 24 prøver i 13 h, med 8 h hands-on tid, eller 16 h, med 9 h hands-on tid, når den valgfrie reamplification trin er påkrævet. Samtidig behandling af flere prøver er opnåeligt, men den begrænsende faktor er centrifuge kapacitet og tekniske færdigheder. Protokollen er udviklet til kræver kun typiske laboratorieudstyr (thermocycler, centrifuge og magnetiske stande) i stedet for specialiseret udstyr, såsom en forstøver eller sonikator, for klipning DNA.
DNA kvalitet, fragment størrelse og mængde er begrænsende faktorer for brug af herbarium modellerne i høj overførselshastighed sekventering eksperimenter. Andre metoder til isolering herbarium DNA og skabe høj overførselshastighed sekventering biblioteker har vist nytten af bruger så lidt som 10 ng af DNA16; men de kræver eksperimentelt bestemme det optimale antal PCR-cykler kræves for biblioteket forberedelse. Dette bliver upraktisk, når der beskæftiger sig med overordentlig meget små mængder af levedygtige dobbelt strandede DNA (dsDNA), da nogle herbarium eksemplarer producerer kun nok DNA til en enkelt bibliotek forberedelse. Metoden præsenteres her bruger en enkelt antal cyklusser uanset prøve kvalitet, så ingen DNA er tabt i biblioteket optimering trin. I stedet, et reamplification skridt er gældende når biblioteker ikke opfylder de minimumsbeløb, der er nødvendige til sekvensering. Mange herbarium prøver er sjældne, og besidde lille materiale gør det vanskeligt at retfærdiggøre destruktiv prøvetagning i mange tilfælde. For at imødegå dette, præsenteres protokollen tillader dsDNA input størrelser mindre end 1,25 ng i forberedelsesprocessen bibliotek, udvidelse af levedygtige prøver for høj overførselshastighed sekvensering og minimere behovet for destruktive udtagning af prøver.
Følgende protokol er blevet optimeret til græsser og testet på hundredvis af forskellige arter fra herbarium prøver, selv om vi forventer, at protokollen kan anvendes til mange andre plantegrupper. Det omfatter en valgfri recovery trin, der kan bruges til at gemme lav kvalitet og/eller sjældne eksemplarer. Baseret på over to hundrede herbarium enheder testet, fungerer denne protokol på enheder med lav væv input og kvalitet, giver mulighed for bevarelse af sjældne eksemplarer gennem minimal destruktiv prøvetagning. Her er det vist, at denne protokol kan levere høj kvalitet biblioteker, der kan blive sekventeret for phylogenomics-baserede projekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen præsenteres her er en omfattende og robust metode til DNA isolation og sekventering bibliotek forberedelse fra tørret plante eksemplarer. Sammenhængen mellem metode og minimal behov for at ændre det baseret på modellen kvalitet gør det skalerbare for store herbarium-baserede sekventering projekter. Medtagelsen af en valgfri reamplification skridt for lavt udbytte biblioteker giver mulighed for optagelse af lav kvalitet, lav mængde, sjælden, eller historisk vigtige prøver, der ellers ikke ville være …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Taylor AuBuchon-ældre, Jordan Teisher, og Kristina Zudock for assistance i prøvetagning herbarium prøver og Missouri botanisk have for adgang til herbarium prøver til destruktiv prøvetagning. Dette arbejde blev støtte af et tilskud fra National Science Foundation (DEB-1457748).
Materials
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
| Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
| Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
| Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
| Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
| Water Bath | VWR | 89032-210 | |
| Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
| Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
| 1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
| Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
| Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
| Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes | ||
References
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
- Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
- Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
- Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
- Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?. Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
- Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
- Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
- Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).
- Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
- Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).
- Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
- Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
- Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
- Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).
- Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
- Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
- Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
- Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
- Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
- Herbarium Genomics. Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- . Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
- McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
- Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
- Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).
- . Transposons Available from: https://github.com/mrmckain/ (2017)
- Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).
- Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).
