Denne artikkelen viser en detaljert protokoll for DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket bygging fra herbarium materiale inkludert redning av svært dårlig kvalitet DNA.
Herbaria er en uvurderlig kilde til plantemateriale som kan brukes i en rekke biologiske studier. Bruk av herbarium er forbundet med en rekke utfordringer som eksempel bevaring kvalitet, degradert DNA og ødeleggende utvalg av sjeldne eksemplarer. Mer effektivt bruke herbarium materiale i store sekvensering prosjekter, er pålitelig og skalerbar metode DNA isolasjon og biblioteket forberedelser nødvendig. Dette dokumentet demonstrerer en robust, begynnelsen-til-ende protokoll for DNA isolasjon og høy gjennomstrømming biblioteket bygging fra herbarium prøver som ikke krever endringer for individuelle prøver. Denne protokollen er skreddersydd for lav kvalitet tørket plante materiale og tar fordel av eksisterende metoder ved å optimalisere vev sliping, endre biblioteket størrelse utvalg og innføre et valgfritt reamplification trinn for lav yield biblioteker. Reamplification lav yield DNA biblioteker kan redde prøver fra uerstattelige og potensielt verdifulle herbarium prøver, benektende behovet for ytterligere destruktive prøvetaking og uten introdusere merkbar sekvensering bias for vanlig Fylogenetiske programmer. Protokollen er testet på hundrevis av grasarter, men forventes å bli anvendelig for bruk i andre plante linjene etter bekreftelse. Denne protokollen kan begrenses av ekstremt degradert DNA, der fragmentene ikke finnes i området ønsket størrelse, og sekundære metabolitter i noen plantemateriale som hemmer ren DNA isolasjon. Samlet introduserer denne protokollen en rask og omfattende metode som tillater DNA isolasjon og biblioteket utarbeidelse av 24 prøvene i mindre enn 13 h, med bare 8 timer aktiv hands-on tid med minimale endringer.
Herbarium samlinger er en potensielt verdifulle arter og genomisk mangfold for studier inkludert phylogenetics1,2,3, Populasjonsgenetikk4,5, konservering biologi6, invasiv Art biologi7og trekk utviklingen8. Muligheten til å få et rikt mangfold av arter, bestander, geografiske steder og tidspunkt høydepunkter “skattekiste”9 som herbarium. Historisk har degradert natur herbarium-avledet DNA hindret PCR-baserte prosjekter, ofte relegating forskere til å bruke bare indikatorer i høy kopien, for eksempel områder chloroplast genomet eller interne transkribert distansestykke (ITS) i ribosomal RNA. Kvaliteten på prøvene og DNA variere mye på metoder for bevaring9,10, med dobbel-strandet pauser og fragmentering av varme i tørking prosessen blir de vanligste formene for skader, skaper den såkalte 90% DNA Lås opp som har encumbered PCR-baserte studier11. Bortsett fra fragmentering er nest vanligste problemet i herbarium genomics forurensning, slik som avledet fra endophytic sopp13 eller sopp ervervet postmortem etter samling, men før montering i den herbarium12, skjønt Dette problemet kan bli løst bioinformatically gitt rett fungal databasen (se nedenfor). En tredje, og mindre vanlig, problemet er sekvensen modifisering gjennom cytosine deamination (C/G→T/A)14, selv om det anslås for å være lav (~ 0,03%) i herbarium prøver11. Med bruk av høy gjennomstrømming sekvensering (HTS), kan spørsmålet om fragmentering overvinnes med kort leser og sekvensering dybde12,15, la genomisk nivå datainnsamling fra mange prøver med lav kvalitet DNA, og noen ganger tillater hele genomet sekvensering15.
Herbarium prøver stadig oftere brukes og er en større del av Fylogenetiske prosjekter16. En gjeldende utfordring å bruke herbarium prøver for HTS er konsekvent få tilstrekkelig double-strandet DNA, en nødvendig forutsetning for sekvensering protokoller, fra mange arter i tide, uten å optimalisere metoder for enkelte prøver. I denne utredningen er en protokoll for DNA utvinning og biblioteket forberedelse av herbarium demonstrert som utnytter eksisterende metoder og modifiserer dem til å tillate rask og repliserbar. Denne metoden gir mulighet for full behandling fra prøven til et bibliotek av 24 prøver i 13 h, med 8 h hands-on tid, eller 16 h, 9 h hands-on tid, når det valgfrie reamplification trinnet kreves. Samtidig behandling av flere prøver er oppnåelig, men den begrensende faktoren er sentrifuge kapasitet og tekniske ferdigheter. Protokollen er utformet krever bare vanlig laboratoriumutstyr (thermocycler, sentrifuger og magnetiske står) i stedet for spesialisert utstyr, som en forstøveren eller sonicator, for shearing DNA.
DNA kvalitet, fragment størrelse og antall er begrensende faktorer for bruk av herbarium høy gjennomstrømming sekvensering eksperimenter. Andre metoder for å isolere herbarium DNA og lage høy gjennomstrømming sekvensering biblioteker har vist verktøyet å bruke så lite som 10 ng DNA16; men de krever eksperimentelt bestemme optimal antall PCR sykluser kreves for biblioteket forberedelse. Dette blir upraktisk når håndtere meget små mengder levedyktig dobbel strandet DNA (dsDNA), som noen herbarium eksemplarer produserer bare nok DNA for en enkelt bibliotek forberedelse. Metoden som presenteres her bruker en enkelt antall sykluser uavhengig av eksempel kvaliteten, så ingen DNA er tapt i biblioteket optimering skritt. I stedet startes et reamplification skritt når biblioteker ikke oppfyller du minimumsbeløpene som kreves for sekvenser. Mange herbarium prøver sjeldne og svært lite stoff vanskelig å rettferdiggjøre destruktive prøvetaking i mange tilfeller. Mot dette presentert protokollen tillater dsDNA inngang størrelser mindre enn 1,25 ng i biblioteket forberedelsesprosessen, utvide omfanget av levedyktig prøver for høy gjennomstrømming sekvensering og minimere behovet for destruktive prøvetaking av prøver.
Følgende protokollen er optimalisert for gress og testet på hundrevis av forskjellige arter fra herbarium prøver, men vi forventer at protokollen kan brukes til mange andre plante grupper. Det inkluderer et valgfritt utvinning skritt som kan brukes til å lagre lav kvalitet og/eller sjeldne eksemplarer. Basert på over to hundre herbarium prøvene testet, fungerer denne protokollen på prøver med lav vev input og kvalitet, slik at for bevaring av sjeldne eksemplarer gjennom minimal destruktive prøvetaking. Her er det vist at denne protokollen kan gi høy kvalitet biblioteker som kan være sekvensert for phylogenomics-baserte prosjekter.
Protokollen presenteres her er en omfattende og robust metode for DNA isolasjon og sekvensering biblioteket forberedelse fra tørkede planter prøver. Konsistensen av metoden og minimalt behov for å endre det basert på prøven kvaliteten gjør det skaleres for store herbarium-baserte sekvensering prosjekter. Inkludering av et valgfritt reamplification trinn for lav yield biblioteker tillater inkludering av lav kvalitet, lav mengde, sjeldne, eller historisk viktige eksempler som ellers ikke ville være egnet for sekvens…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Taylor AuBuchon-eldre, Jordan Teisher, og Kristina Zudock for hjelp i prøvetaking herbarium prøver og Missouri botaniske hagen for tilgang til herbarium prøver for destruktive prøvetaking. Dette arbeidet var støtte av et stipend fra National Science Foundation (DEB-1457748).
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 well |
Gel Imaging System | Azure Biosystems | c300 | |
Microfuge 20 Series | Beckman Coulter | B30137 | |
Digital Dry Bath | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
Electrophoresis System | EasyCast | B2 | |
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) | ELGA | 89204-092 | |
DNA LoBind Tube | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
Mini centrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
Mortar | Fisher Scientific | S02591 | porcelain |
Pestle | fisher Scientific | S02595 | porcelain |
Centrifuge tubes | fisher Scientific | 21-403-161 | |
Microwave | Kenmore | 405.7309231 | |
Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR | VWR | 20170-004 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
Liquid Nitrogen Short-term Storage | Nalgene | F9401 | |
Magnetic-Ring Stand | ThermoFisher Scientific | AM10050 | 96 well |
Water Bath | VWR | 89032-210 | |
Hot Plate Stirrers | VWR | 97042-754 | |
Liquid Nitrogen | Airgas | UN1977 | |
1 X TE Buffer | Ambion | AM9849 | pH 8.0 |
CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
Ribonuclease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml solution |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
Sodium Chloride | bio WORLD | 705744 | |
Isopropyl Alcohol | bio WORLD | 40970004-1 | |
Nuclease Free water | bio WORLD | 42300012-2 | |
Isoamyl Alcohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | s608-500 | |
LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
EDTA, Disodium Salt | IBI Scientific | IB70182 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultra pure |
Gel Loading Dye Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primers Set 1 |
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
GelRed 10000 X | Pheonix Research | 41003-1 | |
Phenol solution | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
Silica sand | VWR | 14808-60-7 | |
Reamplification primers | Integrated DNA Technologies | see text | |
Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes |