Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Summary

Denne artikkelen viser en detaljert protokoll for DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket bygging fra herbarium materiale inkludert redning av svært dårlig kvalitet DNA.

Abstract

Herbaria er en uvurderlig kilde til plantemateriale som kan brukes i en rekke biologiske studier. Bruk av herbarium er forbundet med en rekke utfordringer som eksempel bevaring kvalitet, degradert DNA og ødeleggende utvalg av sjeldne eksemplarer. Mer effektivt bruke herbarium materiale i store sekvensering prosjekter, er pålitelig og skalerbar metode DNA isolasjon og biblioteket forberedelser nødvendig. Dette dokumentet demonstrerer en robust, begynnelsen-til-ende protokoll for DNA isolasjon og høy gjennomstrømming biblioteket bygging fra herbarium prøver som ikke krever endringer for individuelle prøver. Denne protokollen er skreddersydd for lav kvalitet tørket plante materiale og tar fordel av eksisterende metoder ved å optimalisere vev sliping, endre biblioteket størrelse utvalg og innføre et valgfritt reamplification trinn for lav yield biblioteker. Reamplification lav yield DNA biblioteker kan redde prøver fra uerstattelige og potensielt verdifulle herbarium prøver, benektende behovet for ytterligere destruktive prøvetaking og uten introdusere merkbar sekvensering bias for vanlig Fylogenetiske programmer. Protokollen er testet på hundrevis av grasarter, men forventes å bli anvendelig for bruk i andre plante linjene etter bekreftelse. Denne protokollen kan begrenses av ekstremt degradert DNA, der fragmentene ikke finnes i området ønsket størrelse, og sekundære metabolitter i noen plantemateriale som hemmer ren DNA isolasjon. Samlet introduserer denne protokollen en rask og omfattende metode som tillater DNA isolasjon og biblioteket utarbeidelse av 24 prøvene i mindre enn 13 h, med bare 8 timer aktiv hands-on tid med minimale endringer.

Introduction

Herbarium samlinger er en potensielt verdifulle arter og genomisk mangfold for studier inkludert phylogenetics^1,2,3, Populasjonsgenetikk^4,5, konservering biologi⁶, invasiv Art biologi⁷og trekk utviklingen⁸. Muligheten til å få et rikt mangfold av arter, bestander, geografiske steder og tidspunkt høydepunkter “skattekiste”⁹ som herbarium. Historisk har degradert natur herbarium-avledet DNA hindret PCR-baserte prosjekter, ofte relegating forskere til å bruke bare indikatorer i høy kopien, for eksempel områder chloroplast genomet eller interne transkribert distansestykke (ITS) i ribosomal RNA. Kvaliteten på prøvene og DNA variere mye på metoder for bevaring^9,10, med dobbel-strandet pauser og fragmentering av varme i tørking prosessen blir de vanligste formene for skader, skaper den såkalte 90% DNA Lås opp som har encumbered PCR-baserte studier¹¹. Bortsett fra fragmentering er nest vanligste problemet i herbarium genomics forurensning, slik som avledet fra endophytic sopp¹³ eller sopp ervervet postmortem etter samling, men før montering i den herbarium¹², skjønt Dette problemet kan bli løst bioinformatically gitt rett fungal databasen (se nedenfor). En tredje, og mindre vanlig, problemet er sekvensen modifisering gjennom cytosine deamination (C/G→T/A)¹⁴, selv om det anslås for å være lav (~ 0,03%) i herbarium prøver¹¹. Med bruk av høy gjennomstrømming sekvensering (HTS), kan spørsmålet om fragmentering overvinnes med kort leser og sekvensering dybde^12,15, la genomisk nivå datainnsamling fra mange prøver med lav kvalitet DNA, og noen ganger tillater hele genomet sekvensering¹⁵.

Herbarium prøver stadig oftere brukes og er en større del av Fylogenetiske prosjekter¹⁶. En gjeldende utfordring å bruke herbarium prøver for HTS er konsekvent få tilstrekkelig double-strandet DNA, en nødvendig forutsetning for sekvensering protokoller, fra mange arter i tide, uten å optimalisere metoder for enkelte prøver. I denne utredningen er en protokoll for DNA utvinning og biblioteket forberedelse av herbarium demonstrert som utnytter eksisterende metoder og modifiserer dem til å tillate rask og repliserbar. Denne metoden gir mulighet for full behandling fra prøven til et bibliotek av 24 prøver i 13 h, med 8 h hands-on tid, eller 16 h, 9 h hands-on tid, når det valgfrie reamplification trinnet kreves. Samtidig behandling av flere prøver er oppnåelig, men den begrensende faktoren er sentrifuge kapasitet og tekniske ferdigheter. Protokollen er utformet krever bare vanlig laboratoriumutstyr (thermocycler, sentrifuger og magnetiske står) i stedet for spesialisert utstyr, som en forstøveren eller sonicator, for shearing DNA.

DNA kvalitet, fragment størrelse og antall er begrensende faktorer for bruk av herbarium høy gjennomstrømming sekvensering eksperimenter. Andre metoder for å isolere herbarium DNA og lage høy gjennomstrømming sekvensering biblioteker har vist verktøyet å bruke så lite som 10 ng DNA¹⁶; men de krever eksperimentelt bestemme optimal antall PCR sykluser kreves for biblioteket forberedelse. Dette blir upraktisk når håndtere meget små mengder levedyktig dobbel strandet DNA (dsDNA), som noen herbarium eksemplarer produserer bare nok DNA for en enkelt bibliotek forberedelse. Metoden som presenteres her bruker en enkelt antall sykluser uavhengig av eksempel kvaliteten, så ingen DNA er tapt i biblioteket optimering skritt. I stedet startes et reamplification skritt når biblioteker ikke oppfyller du minimumsbeløpene som kreves for sekvenser. Mange herbarium prøver sjeldne og svært lite stoff vanskelig å rettferdiggjøre destruktive prøvetaking i mange tilfeller. Mot dette presentert protokollen tillater dsDNA inngang størrelser mindre enn 1,25 ng i biblioteket forberedelsesprosessen, utvide omfanget av levedyktig prøver for høy gjennomstrømming sekvensering og minimere behovet for destruktive prøvetaking av prøver.

Følgende protokollen er optimalisert for gress og testet på hundrevis av forskjellige arter fra herbarium prøver, men vi forventer at protokollen kan brukes til mange andre plante grupper. Det inkluderer et valgfritt utvinning skritt som kan brukes til å lagre lav kvalitet og/eller sjeldne eksemplarer. Basert på over to hundre herbarium prøvene testet, fungerer denne protokollen på prøver med lav vev input og kvalitet, slik at for bevaring av sjeldne eksemplarer gjennom minimal destruktive prøvetaking. Her er det vist at denne protokollen kan gi høy kvalitet biblioteker som kan være sekvensert for phylogenomics-baserte prosjekter.

Protocol

1. før å starte Gjør frisk cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) buffer17 ved å legge til 20 g CTAB, 10 g polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL 0,5 M ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) pH 8.0, 280.0 mL 5 M NaCl og 400.0 mL reagens vann sammen, og bringe det totale volumet til 1 L bruker reagens-grade vann. Justere pH til 8.0.Merk: Flere reagenser kan legges til CTAB avhengig av sekundær forbindelser i individuelle taxa. Se Allen et al. <sup…

Representative Results

DNA isolasjon og endelige biblioteket avkastningI denne studien ble effekten av protokollen for isolering av herbarium DNA og utvinning av høy kvalitet sekvensering biblioteker demonstrert med 50 forskjellige prøver med den eldste 1920 og den yngste fra 2012 (tabell 2). For hver prøve, var ca 10 mg av blad vev brukes for DNA isolasjon. Grønnere blad vev ble foretrukket hvis tilgjengelig, og ingen vev med åpenbare fungal smitte ble valgt. Vellykke…

Discussion

Protokollen presenteres her er en omfattende og robust metode for DNA isolasjon og sekvensering biblioteket forberedelse fra tørkede planter prøver. Konsistensen av metoden og minimalt behov for å endre det basert på prøven kvaliteten gjør det skaleres for store herbarium-baserte sekvensering prosjekter. Inkludering av et valgfritt reamplification trinn for lav yield biblioteker tillater inkludering av lav kvalitet, lav mengde, sjeldne, eller historisk viktige eksempler som ellers ikke ville være egnet for sekvens…

Materials

Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	4452300	96 well
Gel Imaging System	Azure Biosystems	c300
Microfuge 20 Series	Beckman Coulter	B30137
Digital Dry Bath	Benchmark Scientific	BSH1001
Electrophoresis System	EasyCast	B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water)	ELGA	89204-092
DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108078	2 ml
Mini centrifuge	Fisher Scientific	12-006-901
Vortex-Genie 2	Fisher Scientific	12-812
Mortar	Fisher Scientific	S02591	porcelain
Pestle	fisher Scientific	S02595	porcelain
Centrifuge tubes	fisher Scientific	21-403-161
Microwave	Kenmore	405.7309231
Qubit Assay Tubes	Invitrogen	Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR	VWR	20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866
Balance	Mettler Toledo	PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage	Nalgene	F9401
Magnetic-Ring Stand	ThermoFisher Scientific	AM10050	96 well
Water Bath	VWR	89032-210
Hot Plate Stirrers	VWR	97042-754
Liquid Nitrogen	Airgas	UN1977
1 X TE Buffer	Ambion	AM9849	pH 8.0
CTAB	AMRESCO	0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL	AMRESCO	0482-200ML
Ribonuclease A	AMRESCO	E866-5ML	10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63882
Sodium Chloride	bio WORLD	705744
Isopropyl Alcohol	bio WORLD	40970004-1
Nuclease Free water	bio WORLD	42300012-2
Isoamyl Alcohol	Fisher Scientific	A393-500
Sodium Acetate Trihydrate	Fisher Scientific	s608-500
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder	Gold Biotechnology	D003-500
EDTA, Disodium Salt	IBI Scientific	IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32854
TRIS	MP Biomedicals	103133	ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X)	New England BioLabs	B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England BioLabs	M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina	New England BioLabs	E7600S	Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix	New England BioLabs	M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus	Omega bio-tek	M1386-02
GelRed 10000 X	Pheonix Research	41003-1
Phenol solution	SIGMA Life Science	P4557-400ml
PVP40	SIGMA-Aldrich	PVP40-50G
Chloroform	VWR	EM8.22265.2500
Ethanol	Koptec	V1016	200 Proof
Silica sand	VWR	14808-60-7
Reamplification primers	Integrated DNA Technologies		see text
Sequencher v.5.0.1	GeneCodes