ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס
Summary
כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.
Abstract
תפוקה גבוהה ברמת הגנום RNAi (התערבות ב RNA) הקרנה הטכנולוגיה כבר בשימוש נרחב עבור גילוי מארח גורמים שמשפיעים על שכפול הוירוס. כאן אנו מציגים את היישום של טכנולוגיה זו חשיפת מטרות מארח זה במיוחד לווסת את השכפול של וירוס Maraba, oncolytic כמו כלבת ו וירוס vaccinia עם המטרה של שיפור הטיפול. בעוד הפרוטוקול נבדק לשימוש עם oncolytic Maraba וירוס, oncolytic וירוס vaccinia, גישה זו ישימה על וירוסים אחרים, oncolytic, גם יכול להיות מנוצל לזיהוי מטרות מארח לווסת את שכפול הוירוס בתאים בתרבית של כללי. פרוטוקול זה מתאר את התפתחות של אימות של assay להקרנה RNAi תפוקה גבוהה בתרבית של תאים, שיקולים מרכזיים, צעדים הכנה חשוב עבור ניצוח מסך ראשי RNAi תפוקה גבוהה, מדריך צעד אחר צעד ניצוח מסך ראשי RNAi תפוקה גבוהה; בנוסף, זה בהרחבה מתאר את השיטות לביצוע אימות המסך המשני של לימודי אימות שלישוני. היתרון של תפוקה גבוהה RNAi ההקרנה הוא שזה מאפשר אחד לקטלג, באופן נרחב, לא משוחד, גורמים מארח לווסת את כל היבט של שכפול הוירוס אשר אחד יכול לפתח של assay במבחנה כגון infectivity, פרץ גודל, cytotoxicity. יש את הכוח כדי לחשוף לא צפוי biotherapeutic מטרות בהתבסס על הידע הנוכחי.
Introduction
תפוקה גבוהה ברמת הגנום RNAi ההקרנה הוכיחה להיות כלי רב ערך לחשוף תובנות ביולוגי במגוון תחומים של המחקר כולל וירוסים ביולוגיה. במהלך העשור האחרון או משהו כזה, קבוצות רבות ובהבנתנו מבוססת תא בקנה מידה גדול RNAi הקרנת בהרחבה לזהות גנים המארח לווסת את וירוס שכפול (אירוע של יום שלם1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). מעניין, מספר גדול של המסכים הבאים נערכו ב תאים סרטניים וכמה עם וירוסים כי הם מועמדים וירוס oncolytic הנוכחי, ובהם vaccinia וירוס8,9,10 , Myxoma וירוס11, וירוס הרפס סימפלקס12,13,וירוס vesicular stomatitis14ו- Maraba וירוס15. המוקד של הרוב המכריע של מחקרים אלו היה על זיהוי המארח גורמים המשפיעים על יחס מסוים של וירוס שכפול ולא על זיהוי מטרות biotherapeutic לשיפור oncolytic וירוס טיפול, נתונים יקרי ערך יכול להיות הנכרה ערכות נתונים אלה ב- בעניין זה. ברור כי הפוטנציאל רב עוצמה לזיהוי מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic לא לגמרי נוצלה.
שפע של oncolytic וירוס פלטפורמות נבדקות כעת בקליניים וקליניים כולל הרפס סימפלקס וירוס, reovirus, vaccinia וירוס, אשר היו הניתנת הצלחה בניסויים קליניים בשלב מאוחר. עבור רוב פלטפורמות אלה, המאמצים מכוונת כלפי שינוי הגנום וירוס כדי לשפר את הטיפול. למשל, כדי להגביר את הגידול ירידה לפרטים, נגיף מסוים גנים נמחקו או מוטציה להגביל באופן משמעותי את שכפול ויראלי תאים נורמליים, אך לא תאים סרטניים. במקרים מסוימים, transgenes נוספו כמו GM-CSF (גרנולוציט מקרופאג המושבה-מגרה פקטור) פלאטין התגובה החיסונית או ש ח (סודיום יודיד symporter) כדי לאפשר הדמיה vivo בתוך ספיגת radioiodide הסלולר עבור טיפולית מטרות. עם זאת, היו מעט מאוד עבודה ממוקדת על גנים המארח/גידול מניפולציה לחקור את ההשפעה של גנים המארח/גידול על שכפול הוירוס oncolytic. עם כניסתו של טכנולוגיית הקרנה תפוקה גבוהה, עכשיו זה אפשרי כדי לחקור מארח-וירוס אינטראקציות בקנה מידה הגנום וכדי לפענח הזדמנויות כדי לתפעל את הגנום המארח כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic (שבתוך16, 17,18).
דווח המחקר המפגינים ההוכחה-של-הרעיון הראשון לשימוש תפוקה גבוהה גנטי ההקרנה כדי לזהות מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic. לגלות גנים המארח לווסת את Maraba וירוס oncolysis, כמו כלבת oncolytic כרגע נבדק בשלב II ניסויים, ואני ערכנו ברמת הגנום RNAi המסכים על פני שלוש שורות תאים גידול שונים בכפילות עם siRNA (התערבות RNA קצר) ספריית מיקוד גנים 18,12015. ניתוח מסלול בנפילות שאותרו במסכים חשף העשרה של חברי המסלולים תגובת הלחץ בחדר המיון (רשתית תוך-פלזמית). בחרנו 10 כדורי בתוך המסלולים הללו עבור אימות משני באמצעות siRNA עם רצפי מיקוד שונות מאלה של המסך הראשי. כחלק מאימות שלישוני, ערכנו ניסוי הצלה עם IRE1α (אינוזיטול הדורשים אלפא אנזים 1) המאשרת החיסול בוצע על המטרה. במבחנה ויוו ובדיקה של שימוש מעכב מולקולה קטנה של IRE1α הביאה יעילות משופרת באופן משמעותי oncolytic.
. Workenhe et al. 12 ניצח גם ברמת הגנום RNAi מסך באמצעות shRNA lentiviral במאגר של (קצר סיכת ראש ה-RNA) ספריית מיקוד גנים 16,056 כדי לזהות גורמים מארח הגבלת נגיף הרפס סימפלקס האדם סוג 1 (HSV-1) מוטציה בתיווך KM100 oncolysis של השד תאים סרטניים. במסך הראשי, הם זיהו את הגנים 343 את נוקאאוט של איזה להוביל cytotoxicity משופרת של תאים הנגועים KM100 על פני תאים הנגועים ואימץ; הם נבחרים 24 הגנים האלה עבור אימות משנית. מתוך 24 גנים, גנים 8 אומתו המסך המשני עם אחד מהם להיות SRSF2 (סרין/ארגינין-עשיר שחבור פקטור 2), אשר לאחר מכן אושרה באמצעות ניסוי גנטי הצלה במהלך אימות שלישוני. הקבוצה המשיך לזיהוי DNA טופואיזומראז מעכב כימותרפיות מופחתת זירחון של SRSF2, הראה כי הטיפול בשילוב של HSV-1 KM100 עם הפניה זו מעכב להישרדות מורחבת של עכברים נושאות TUBO.
במחקרים שהוזכרו לעיל, עקבו אחרי זרימת עבודה דומה. זה החל עם מסך ראשי ברמת הגנום RNAi ואחריו מסך משני על מספר נבחר של בנפילות שאותרו במסך הראשי. זאת בעקבות לימודי אימות שלישוני, שכללה המאשר כי הלהיט היה על המטרה על ידי ביצוע גנטי להציל ניסויים חוץ גופית בתוך עם אימות האולטימטיבי שבוצעה על-ידי מניפולציה את המוצר ג’ין היעד בתוך vivo. במאמר זה, אנו קודם מספקים פרוטוקול כללי עבור פיתוח, אימות של assay siRNA-הקרנה תפוקה גבוהה, אשר כרוכה בקביעת התנאים אופטימליים תרביות תאים, כמות של וירוס, ואורך של זיהום. אנו מציעים גם פרוטוקול מפורט לביצוע עיקרי מסך siRNA תפוקה גבוהה, כמו גם תיאור של הכללית של השיטה לביצוע במסך משני אימות ובדיקת שלישוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לזהות מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic. זה נבדק בהצלחה עם oncolytic Maraba וירוס, וירוס vaccinia oncolytic, אבל, כאמור, זה ניתן להתאים לשימוש עם וירוסים אחרים, oncolytic או וירוסים אחרים בדרך כלל לזהות גנים המארח לווסת את וירוס …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממכון אונטריו למחקר סרטן, קרן קנדה חדשנות, קרן סרטן אוטווה האזורי של מכון המחקר של שועל טרי. K.J.A. נתמך על ידי וניהר קנדה במלגה ללימודי תואר שני, מוסד קנדי לפרס של הבריאות מחקר-מאסטר, מלגות לתואר שני של אונטריו.
Materials
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?. Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -. Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -. V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -. P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
