Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic
Summary
Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.
Abstract
Tecnologia di retinatura di alto-rendimento genoma RNAi (RNA interference) è stato ampiamente utilizzata per scoprire i fattori che influenzano la replicazione del virus. Qui presentiamo l’applicazione di questa tecnologia per scoprire obiettivi di host che specificamente modulano la replica di Maraba virus oncolytic rhabdovirus e un papilloma virus con l’obiettivo di migliorare la terapia. Mentre il protocollo è stato testato per l’utilizzo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, questo approccio è applicabile ad altri virus oncolytic e può essere utilizzato anche per identificare gli obiettivi di host che modulano la replicazione del virus nelle cellule di mammifero in generale. Questo protocollo descrive lo sviluppo e la validazione di un test per HTS RNAi in cellule di mammifero, le considerazioni chiave e importante per lo svolgimento di uno schermo di RNAi ad alta produttività primario e una guida dettagliata per la procedura di preparazione lo svolgimento di uno schermo di RNAi di alto-rendimento primario; Inoltre, largamente descrive i metodi per lo svolgimento di convalida lo schermo secondario e terziario convalida gli studi. Il beneficio del RNAi high throughput screening è che permette di catalogare, in modo ampio e imparziali, fattori dell’ospite che modulano qualsiasi aspetto della replicazione del virus per il quale si può sviluppare un test in vitro quali infettività, dimensione, burst e citotossicità. Ha il potere di scoprire bioterapeutici obiettivi imprevisti sulla base delle attuali conoscenze.
Introduction
HTS RNAi genoma ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per rivelare intuizioni biologiche in diverse aree di studio tra cui biologia del virus. Nel corso degli ultimi dieci anni o così, numerosi gruppi hanno intrapreso basati su cellule su larga scala lo screening RNAi per estesamente identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus (rivisto1,2,3,,4 , 5 , 6 , 7). interessante, un gran numero di questi schermi è stati condotti in cellule di cancro e diverse con virus che sono attuali candidati dei virus oncolytic compreso vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, stomatite vescicolare virus13,14e Maraba virus15. Mentre l’attenzione della maggior parte di questi studi era sull’individuazione di fattori dell’ospite che influenzano alcuni aspetti della replicazione del virus e non sull’identificazione di bersagli bioterapeutici per migliorare la terapia del virus oncolytic, preziosi dati potrebbero essere Estratto da questi insiemi di dati in questo proposito. È chiaro che il potenziale potente per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic non è stato pienamente sfruttato.
Una pletora di piattaforme virus oncolytic sono attualmente in fase di test in studi preclinici e clinici tra cui herpes simplex virus, reovirus e vaccinia virus, che hanno avuto successo dimostrabile in ritardo-fase di test clinici. Per la maggior parte di queste piattaforme, gli sforzi sono stati diretti verso alterando i genomi di virus per migliorare la terapia. Per esempio, per aumentare la specificità del tumore, geni specifici virus sono stati eliminati o mutati per limitare significativamente la replicazione virale in cellule normali, ma non in cellule del tumore. In alcuni casi, i transgeni sono stati aggiunti come GM-CSF (fattore distimolazione del macrofago del granulocyte) per potenziare la risposta immunitaria o NIS (symporter ioduro di sodio) per attivare in vivo imaging e l’assorbimento cellulare di radioiodide per terapeutico fini. Tuttavia, ci è stato molto poco lavoro incentrata sulla manipolazione dei geni host/tumore ed esplorare l’impatto dei geni ospite/tumore sulla replicazione del virus oncolytic. Con l’avvento della tecnologia high throughput screening, è ora possibile per sondare le interazioni ospite-virus su una scala di genoma e decifrare le opportunità di manipolare il genoma ospite per migliorare la terapia virus oncolytic (recensione a16, 17,18).
Abbiamo segnalato il primo studio che dimostra di prova per l’utilizzo di high throughput screening per identificare bersagli di host che potrebbero essere modificati per migliorare la terapia virus oncolytic genetico. Per scoprire i geni ospitanti che modulano Maraba virus oncolitici, un rhabdovirus oncolytic attualmente in fase di sperimentazione in fase I e studi II, abbiamo condotto schermi RNAi genoma attraverso tre linee cellulari differenti del tumore in duplice copia con un siRNA (breve interferenza RNA) Biblioteca 18.120 geni15di targeting. Analisi dei percorsi dei successi identificato nelle schermate ha rivelato arricchimento dei membri della vie di risposta di sforzo ER (reticolo endoplasmatico). Abbiamo selezionato 10 colpi all’interno di queste vie per la convalida secondario utilizzando siRNA con sequenze di destinazione diversi da quelli della schermata principale. Come parte della convalida terziario, abbiamo condotto un esperimento di salvataggio con IRE1α (inositolo-richiedere alfa enzima 1) per confermare che il colpo era il bersaglio. In vitro e in vivo test utilizzando un inibitore di piccola molecola di IRE1α ha provocato oncolytic drammaticamente maggiore efficacia.
Workenhe et al. 12 ha anche condotto una schermata di RNAi genoma utilizzando un pool lentivirale shRNA (short hairpin RNA) libreria targeting 16.056 geni per identificare fattori ospite limitando il virus di simplex di erpete umano tipo 1 (HSV-1) oncolitici mutante KM100-mediata del seno cellule tumorali. Nella schermata principale, hanno identificato i 343 geni l’atterramento di che conducono alla citotossicità migliorata delle cellule infettate KM100 sopra cellule mock-infettate; hanno selezionato 24 di questi geni per convalida secondario. Fuori i 24 geni, 8 geni sono stati confermati nella schermata secondaria con uno di loro essendo SRSF2 (serina/arginina-ricco splicing factor 2), che successivamente è stata confermata usando un esperimento genetico salvataggio durante la convalida del terziario. Il gruppo proseguì per identificare un inibitore della topoisomerasi del DNA chemioterapico che ridotto la fosforilazione di SRSF2 e ha dimostrato che il trattamento di combinazione di HSV-1 KM100 con questo inibitore ha portato alla sopravvivenza estesa dei topi del tumore-cuscinetto TUBO.
Negli studi di cui sopra, è stato seguito un simile flusso di lavoro. Ciascuno ha cominciato con uno schermo di RNAi genoma primario seguito da una schermata secondaria su un numero selezionato di colpi identificati nella schermata principale. Ciò è stata seguita da studi di validazione terziaria, che comprendeva confermando che il colpo era il bersaglio eseguendo genetica rescue esperimenti in vitro con ultima convalida eseguita manipolando la destinazione gene prodotto in vivo. In questo articolo, forniamo prima un protocollo generale per lo sviluppo e la validazione di un test di siRNA-screening ad alta velocità, che consiste nel determinare le condizioni ottimali di transfezione, quantità di virus e la lunghezza dell’infezione. Offriamo anche un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un primario, uno schermo di alto-rendimento siRNA, nonché una descrizione generale del metodo per l’esecuzione di convalida lo schermo secondario e terziario convalida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo un protocollo per impiegare HTS RNAi per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic. Questo è stato testato con successo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, ma, come osservato, può essere adattato per l’uso con altri virus oncolytic o altri virus in genere per identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus. Il protocollo di screening è inoltre progettato per identificare i geni che aumentano o d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni da Ontario Institute per ricerca sul cancro, la Fondazione canadese per l’innovazione, l’Ottawa Regional Cancer Foundation e l’Istituto di ricerca di Terry Fox. K.J.A. è stata sostenuta da un Vanier Canada Graduate Scholarship, un Istituto canadese per la salute-Master di ricerca Award e una borsa di studio laureato di Ontario.
Materials
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
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