腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング
Summary
ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア ウイルス療法が、それが他的に容易に適応することができますウイルスのプラットフォームまたは一般にウイルスの複製を調節する宿主遺伝子を発見するため。
Abstract
高スループット ゲノムワイド RNAi (RNA 干渉) スクリーニング技術は、ウイルスの複製に影響を及ぼす宿主因子を発見するため広く使用されています。具体的には強化療法の目標と Maraba ウイルス、腫瘍溶解性ラブド ウイルスについて、ワクシニア ウイルスの複製を調節する発見のホスト ターゲットにこの技術のアプリケーションをご紹介します。腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルスで使用するプロトコルをテストされています、このアプローチ他腫瘍溶解性ウイルスに適用されます、哺乳類細胞でのウイルス増殖を調節するホスト ターゲットを識別することができます活用も一般的です。このプロトコルは、開発および哺乳類細胞、重要な考慮事項と準備手順プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングとステップバイ ステップのガイドを行うために重要でハイスループット RNAi スクリーニング アッセイの検証について説明します。プライマリ ハイスループット RNAi スクリーニングの実施さらに、それは広くセカンダリ画面検証・第三紀の検証研究を行う方法をについて説明します。ハイスループット RNAi スクリーニングができる広範かつ公平な方法、感染などの in vitroアッセイを開発 1 つのウイルスの複製のあらゆる側面を調節する宿主因子で、カタログに 1 つの利点はバースト サイズ毒性。それは現在の知識に基づいて生物学的製剤ターゲット不測の事態を明らかにする力があります。
Introduction
高速全ゲノム RNAi スクリーニングは、ウイルス生物学などの多様な分野で生物学的洞察力を明らかにするための貴重なツールであると証明しました。広くウイルスの複製 (1,2,3,4のレビューを調節する宿主遺伝子を識別するの大規模な RNAi スクリーニングのセルベースの過去 10 年間以上にわたり多数のグループが実施しています。,5,6,7). 癌細胞、ワクシニア ウイルス8,9,10 を含む現在の腫瘍溶解性ウイルス候補であるウイルスといくつかの興味深いことに、これらの画面の数が多いを行った、Maraba ウイルス15水胞性口炎ウイルス13,14, 単純ヘルペス ウイルス12粘液腫ウイルス11。貴重なデータがのこれらのデータ セットから採掘される可能性ウイルスの複製のいくつかの側面に影響を与えるホストの要因を識別するのではなく、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化するための生物学的製剤のターゲットを識別するこれらの研究のほとんどの焦点中、この点では。腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために強力な潜在性がない完全に悪用されるは明らかです。
腫瘍溶解性ウイルス プラットフォームの茄多は、後期臨床試験で明白な成功を収めているヘルペス シンプレックス ウイルス、レオウイルス、ワクシニア ウイルスを含む前臨床および臨床研究で現在テストされています。これらのプラットフォームの大半、努力に向かっていたウイルスのゲノムを変える治療を強化します。例えば、腫瘍特異性を増加する特定のウイルス遺伝子削除されたか通常の細胞が腫瘍細胞ではウイルスの複製を大幅に制限する変異します。いくつかのケースでの GM-CSF (顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子) を免疫反応を増強するまたは NIS (ナトリウム ヨウ化シンポート) in vivoイメージングと細胞における放射性の取り込みを有効にするような遺伝子が追加されて治療目的。ただし、ホスト/腫瘍の遺伝子を操作し、探索の腫瘍溶解性ウイルスの複製のホスト/腫瘍遺伝子の影響に焦点を当ててほとんどの仕事がずっとあります。ハイスループットス クリーニング技術の出現により、腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する宿主ゲノムを操作する機会を解読する、ゲノム規模でのホスト ウイルスの相互作用を調査することが可能です今 (見直し16, 17,18)。
我々 は報告、最初研究デモの概念実証ハイスループット遺伝の腫瘍溶解性ウイルス治療を強化する操作することができるホストのターゲットを識別するためにスクリーニングを使用するためです。Maraba ウイルス腫瘍、現在フェーズでテストされている腫瘍溶解性ラブドウイルスーを調節する宿主遺伝子を発見するには、私と第 II 試験を行った全ゲノム RNAi 画面 siRNA (短い干渉 RNA) と重複で 3 つの異なる腫瘍細胞株全体18,120 遺伝子15をターゲット ライブラリ。ヒットの画面で特定の経路分析では、(小胞体) 小胞体ストレス応答経路のメンバーの濃縮を明らかにしました。主な画面のものと異なるターゲット シーケンスに siRNA を用いた二次検証のためこれらの経路内で 10 安打を選びました。第三紀の検証の一環として、ire1 α とレスキュー実験を行い (イノシトール要求酵素 1 アルファ) あたりがターゲットにされたことを確認します。体外と体内ire1 α の小分子阻害薬を使用してテスト結果大幅に強化された腫瘍溶解性効果。
Workenheら12もプール レンチ ウイルス shRNA (短いヘアピン RNA) を使用して全ゲノム RNAi スクリーニングを実施したひと単純ヘルペス ウイルスを制限するホストの要因を識別する 16,056 遺伝子をターゲット ライブラリ タイプの胸の 1 (HSV-1) 変異 KM100 を介した腫瘍癌細胞。プライマリ画面彼らはモック感染細胞; 上 KM100 感染細胞の細胞毒性の強化につながるのノックダウンの 343 遺伝子を同定しました。彼らは二次検証のためのこれらの遺伝子の 24 を選択されています。24 遺伝子のうち 8 遺伝子がそれらの 1 つを持つセカンダリ画面で確認された第三の検証中に遺伝的レスキュー実験を使用して確認された後 (セリン/アルギニンリッチ スプライシング因子 2) SRSF2 をされています。グループは SRSF2 のリン酸化の減少、吐蕃担癌マウスの拡張生存率にこの阻害剤リードと HSV 1 KM100 の組み合わせ治療, DNA トポイソメラーゼ阻害療法を識別するようになった。
前述の調査で似たようなワークフローが続いた。各選択プライマリ画面で特定のヒット数でセカンダリ画面が続く主な全ゲノム RNAi スクリーニングから始まった。これはヒットした対象であることを確認含まれている第三の検証研究が続いた遺伝を実行してターゲット遺伝子プロダクトの vivoの操作によって実行される究極の検証と実験で試験管を救出します。この記事でまずウイルスの量と感染症の最適なトランスフェクション条件の決定は、高スループットの siRNA スクリーニング アッセイの開発性の一般的なプロトコルを提供します。セカンダリ画面検証および第三紀の検証の実行方法の全体的な説明と同様、高スループット siRNA スクリーンもプライマリを実施するための詳細なプロトコルを承っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ハイスループット RNAi スクリーニング腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを識別するために採用するためのプロトコルをご紹介します。これは、腫瘍溶解性 Maraba ウイルスと腫瘍溶解性ワクシニア ウイルス、正常にテストされていますが、前述のように、適応できる他の腫瘍溶解性ウイルスや他のウイルスを使用一般にウイルスの複製を調節す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、イノベーション ・ オタワ地域がん財団・ テリー Fox 研究所がん研究、カナダの財団のオンタリオの研究所からの助成金によって支えられました。K.J.A. は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金、健康研究マスター賞のためのカナダの研究所によって支えられたとオンタリオ州大学院奨学金。
Materials
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
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