Genomet hele RNAi Screening å identifisere vert faktorer som modulerer kan viruset terapi
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å ansette høy gjennomstrømming RNAi screening å avdekke vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi, spesielt rhabodvirus og vaccinia virus terapi, men det kan være lett tilpasses andre kan virus plattformer eller for å oppdage vert gener som modulerer virus replikering generelt.
Abstract
Høy gjennomstrømming genomet hele RNAi (RNA-interferens) screening teknologi har vært mye brukt for å oppdage vert faktorer som påvirker virus replikering. Her presenterer vi bruk av denne teknologien for å avdekke vert mål som spesielt modulerer replikering av Maraba virus, kan rhabdovirus, og vaccinia virus med mål om å forbedre terapi. Mens protokollen har blitt testet for bruk med kan Maraba virus og kan vaccinia virus, dette gjelder for andre kan virus og kan benyttes for å identifisere vert mål som modulerer virus replikasjon i pattedyrceller i generelt. Denne protokollen beskriver utvikling og validering av analysen for høy gjennomstrømming RNAi screening i pattedyrceller, nøkkelfaktorer og klargjøringstrinn som er viktige for å utføre en primær høy gjennomstrømming RNAi skjerm, og en trinnvis innføring i gjennomføre en primær høy gjennomstrømming RNAi skjermen. i tillegg beskriver det grovt metodene for å gjennomføre sekundær skjerm validering og tertiær validering studier. Fordelen med høy gjennomstrømming RNAi screening er at det gjør det mulig å katalogisere, i en omfattende og upartiske mote, vert faktorer som modulerer noen aspekter av viruset replikering som man kan utvikle i vitro analysen som infectivity, brast størrelse, og cytotoksisitet. Det har makt til å avdekke biotherapeutic mål uforutsette basert på dagens kunnskap.
Introduction
Høy gjennomstrømming genomet hele RNAi screening har vist seg for å være et uvurderlig verktøy for å avsløre biologiske innsikt i ulike områder av studiet inkludert virus biologi. Det siste tiåret eller så, har mange grupper foretatt cellebasert storstilt RNAi screening for å identifisere mye vert gener som modulerer virus replikering (anmeldt i1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). interessant, mange av disse skjermene har vært utført i kreftceller og flere med virus som er gjeldende kan virus kandidater inkludert vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, vesicular stomatitt virus13,14og Maraba virus15. Mens fokus for fleste av disse studiene var identifisere vert faktorer som påvirker noen aspekter av viruset replikering og ikke identifisere biotherapeutic mål for forbedring kan viruset terapi, kan verdifulle data være minelagt fra disse datasett i denne forbindelse. Det er klart at mektige potensialet til å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi ikke har blitt fullt utnyttet.
En mengde kan virus plattformer blir nå testet i prekliniske og kliniske studier inkludert herpes simplex virus, reovirus og vaccinia virus, som har hatt påviselig suksess i sent kliniske forsøk. For fleste av disse plattformene, har innsatsen vært rettet mot endre virus genomer å forbedre terapi. For eksempel, for å øke svulst spesifisitet, er spesifikt virus gener slettet eller mutert for å begrense viral replikasjon i normale celler, men ikke i kreftceller. I noen tilfeller effekter av transgener ha blitt addert som GM-CSF (granulocytt macrophage koloni-stimulerende faktor) å forsterke immunforsvaret eller NIS (natrium iodide symporter) å aktivere i vivo bildebehandling og mobilnettet radioiodide opptak for terapeutisk formål. Imidlertid har det vært svært lite arbeid fokusert på manipulere vert/svulst gener og utforske virkningen av vert/svulst gener på kan virus replikering. Med bruk av høy gjennomstrømming screening teknologi, er det nå mulig å sondere vert-virus interaksjoner i genomet skala og dechiffrere muligheter manipulere vert genomet for å forbedre kan viruset terapi (omtalt i16, 17,18).
Vi rapporterte den første studie demonstrere proof-of-concept for bruk av høy gjennomstrømming genetisk screening for å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi. For å oppdage vert gener som modulerer Maraba virus oncolysis, en kan rhabdovirus testes i fasen jeg og II prøvelser, vi gjennomført genomet hele RNAi skjermer over tre forskjellige svulst cellelinjer i duplikat med en siRNA (kort konflikt RNA) bibliotek målretting 18,120 gener15. Sti analyse av treff i skjermene avdekket anriking av medlemmer av de ER (endoplasmatiske retikulum) stress respons. Vi valgte 10 treff i disse trasé for sekundær godkjenningen siRNA med forskjellige målretting sekvenser fra de primære skjermen. Som del av tertiær validering, gjennomførte vi en redning eksperimentere med IRE1α (inositol-krever enzym 1 alfa) til at treffet var på målet. In vitro og i vivo testing ved bruk av et lite molekyl inhibitor av IRE1α resulterte i dramatisk forbedret kan effekt.
Workenhe et al. 12 også gjennomført et genom hele RNAi skjermen ved hjelp av en gruppert lentiviral shRNA (kort hårnål RNA) bibliotek målretting 16,056 gener for å identifisere vert faktorer begrense menneskelig herpes simplex virus type 1 (HSV-1) mutant KM100-mediert oncolysis bryst kreftceller. Primære skjermen identifisert de 343 gener knockdown fører til forbedret cytotoksisitet KM100-infiserte celler over uekte-infiserte celler. de valgte 24 av disse genene for sekundær validering. Av 24 genene, 8 gener ble bekreftet i sekundære skjermen med en av dem som SRSF2 (serine/arginine-rik skjøting faktor 2) senere bekreftet ved hjelp av en genetisk redning eksperiment under tertiær valideringen. Gruppen fortsatte med å identifisere en DNA topoisomerase hemmer chemotherapeutic som redusert fosforylering i SRSF2 og viste at Kombinasjonsbehandling av HSV-1 KM100 med dette hemmer fører til lengre overlevelse TUBO svulst rentebærende mus.
I de nevnte studiene, ble en lignende arbeidsflyt fulgt. Hver begynte med en primær genomet-RNAi widescreen etterfulgt av en sekundær skjerm på et utvalgt antall treff i primære skjermen. Dette ble etterfulgt av tertiær validering studier, som bekrefter at treffet var på målet ved å utføre genetiske redde eksperimenter i vitro med ultimate validering utført ved å manipulere målet gene produktet i vivo. I denne artikkelen gi vi først en generell protokoll for utvikling og validering av en høy gjennomstrømming siRNA-screening analysen, som innebærer å bestemme de optimale transfection forholdene, mengde virus, og lengden på infeksjon. Vi tilbyr også en detaljert protokoll for å gjennomføre en primær en høy gjennomstrømming siRNA skjerm samt en helhetlig beskrivelse av metoden for å utføre sekundær skjerm validering og tertiær validering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for å ansette høy gjennomstrømming RNAi screening å identifisere vert mål som kan manipuleres til å forbedre kan viruset terapi. Dette har blitt testet med suksess med kan Maraba virus og kan vaccinia virus, men som nevnt, det kan tilpasses for bruk med andre kan virus eller andre virus vanligvis identifisere vert gener som modulerer virus replikering. Screening protokollen er også utformet for å identifisere tilblivelse det øke eller redusere spredt, men det kan være lett modifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Ontario Institutt for kreftforskning, Canada grunnlaget for innovasjon, Ottawa regionale Cancer Foundation og Terry Fox Research Institute. K.J.A. ble støttet av en Vanier Canada Graduate Scholarship, en kanadisk Institute for Health Research-Master-prisen, og en Ontario Graduate Scholarship.
Materials
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions?. Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -. Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -. V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -. P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
