Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en handige methode voor het opslaan van perifeer bloed en serum/plasma voor downstream analyses uitgevoerd, zoals single nucleotide polymorphism (SNP) evaluatie en analyse ELISA.
Abstract
Bloed monster kwaliteit is van cruciaal belang om ervoor te zorgen nauwkeurige downstream analyses uitgevoerd, zoals real-time PCR of ELISA. Juiste opslag van biologische materialen is het uitgangspunt om reproduceerbare en betrouwbare resultaten te bereiken. Alle monsters moeten worden behandeld op dezelfde wijze uit bloed collectie naar opslag. Afhankelijk van de analyses worden uitgevoerd, moeten volbloed en serummonsters worden opgeslagen bij-20 ° C of -80 ° C tot gebruik. Bloed/serum monsters moeten ook worden aliquoted om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien. Een ander belangrijk punt is de steekproef voorwaarden tijdens de verzending van een laboratorium naar de andere. Als droog ijs niet beschikbaar is of de verzending langer dan een paar dagen duurt, zijn alternatieve benaderingen nodig. É㠩 n optie is het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling. Hier stellen wij een methode voor bloed en serum sample collectie die van profiteert gedroogd bloed vlekken (DBS) en gedroogd serum vlekken (DSS). We ontwikkelden de procedure om uit te pakken van DNA van DBS voor de downstream evaluatie van sommige één nucleotidepolymorfisme (SNPs) door real-time PCR. Wij ook een analyse van de ELISA vanaf eiwitten geëlueerd van DSS geoptimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt met andere ELISA testen of de procedures evaluatie van eiwitten.
Introduction
Het belangrijkste doel van het onderzoek naar kanker biomarkers is de identificatie van nieuwe biologische parameters die kunnen worden gebruikt voor diagnose, voorspellen patiënt prognose en voor het bepalen of een patiënt op een specifieke behandeling reageren zal. Deze onderzoekruimte is van fundamenteel belang voor de ontdekking van innovatieve kankerbehandelingen en speelt een sleutelrol in op maat gemaakte behandeling.
De procedures die zijn uitgevoerd tijdens elke stap van biomerker identificatie en validatie moet betrouwbaar en reproduceerbaar. Een hoeksteen voor het welslagen van translationeel onderzoek is de juiste opslag van biologische monsters zoals bloed en serum. Dit is de eerste stap op weg naar het verkrijgen van hoge kwaliteit biologisch materiaal dat kan worden gebruikt voor het moleculaire biologie-experimenten of eiwit tests uitvoeren.
Multicenter studies zijn vaak nodig om te werven genoeg patiënten om robuuste gegevens te verkrijgen. Niet alle instituten zijn in staat om op te slaan van de monsters bij-80 ° C of monsters verzenden naar andere internationale centra in droog ijs. Het gebruik van filtreerpapier voor bloedinzameling is een eenvoudige methode voor het opslaan van bloed en serum en vereist niet de onmiddellijke bevriezing van monsters1,2. Een druppel bloed of serum gespot kan worden op het papier, overgelaten aan droge overnachting en vervolgens opgeslagen voor maximaal 14 dagen bij kamertemperatuur1,2. Dit geeft onderzoekers tijd voor het verzenden van de monsters met andere laboratoria. Het gebruik van gedroogde bloed vlekken (DBS) en gedroogde serum vlekken (DSS) kon dus vereenvoudiging van de samenwerking tussen instituten in ontwikkelde en ontwikkelingslanden.
Gezien haar gebruiksgemak, wordt DBS bemonstering veel gebruikt in verschillende soorten testen voor serologische of genetische downstream analyses. Bijvoorbeeld, in het verleden, werden DBS vaak gebruikt voor HIV screening in ontwikkelingslanden1,2,3,4,5. Een ander voordeel van deze opslagmethode is dat bloedmonsters van vinger-prikt, waardoor het gebruik ervan voor pasgeboren screening tests 6,7,8kunnen worden verzameld. Eenvoudig voorbeeld verladen en het vervoer zijn verdere voordelen van DBS, vooral voor monsters die op externe sites waar er geen laboratoriumapparatuur is. In een eerdere publicatie gebruikten we DBS en DSS vitamine D en vitamine D-bindend-proteïne (DBP) testen in een reeks van Kaukasische en Afrikaanse patiënten9. Onze Afrikaanse collega's waren niet in staat om droog ijs. Om te vergelijken de biologische markers om te begrijpen van de verschillen in de vitamine D-traject tussen de twee etnische bevolkingsgroepen, verbeterd we verder de procedure met behulp van gecompenseerde monsters opgeslagen onder normale omstandigheden en op filterpapier. Na het optimaliseren van de procedure DBS/DSS, konden we om DBP en vitamine D in het serum van de patiënt in beide cohorten te analyseren. Wij ook een aantal interne nucleotidepolymorfisme (SNPs) na DNA-extractie uit volbloed voor blanken en DBS voor Afrikanen9geëvalueerd. Dit protocol maakt hoge kwaliteit bloedmonsters bij kamertemperatuur worden opgeslagen zonder dat verschillende soorten downstream analyses, variërend van de moleculaire biologie tot ELISA testen. Het wordt aanbevolen voor gebruik voor het beheer van biologische materialen in multicenter studies of centra die nog geen voorzieningen voor standaard bewaarcondities. Het volgende protocol vertegenwoordigt het hoogtepunt van deze geoptimaliseerde procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Perifeer bloed en serum werden verzameld en opgeslagen van gezonde donoren en patiënten die gaf schriftelijke geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de studie. Het studie-protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische Commissie volgens de ethische normen vastgelegd in de verklaring van Helsinki van 1964.
1. bloed-opslag in DBS
-
Bloed monster collectie
- Verzamelen van perifeer bloedmonster in een tube 3 mL met 5.4 mg ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 3 mL.
Opmerking: Bewaar perifeer bloed als DBS zo spoedig mogelijk en binnen 8 uur. - De patiënt codenummer op de rechter benedenhoek van de Spaarder kaart schrijven.
- Zorgvuldig resuspendeer de bloed met een 5 mL-pipet.
- Verzamelen van perifeer bloedmonster in een tube 3 mL met 5.4 mg ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) 3 mL.
-
Bloed spotten op DBS
- Pipetteer af en breng een plek van bloed (50 µL) op de kaart van saver (Tabel of Materials) met een 50-200 µL tip.
- Herhaal stap 1.2.1. hebben een totaal van 3 – 5 bloed vlekken. De oude tip negeren en een nieuwe een voor elke bloed aliquoot nemen.
- Laat de DBS aan droge overnachting bij kamertemperatuur in een horizontale positie over een open niet-absorberend oppervlak, vermijden van direct zonlicht. Laat de cover van de Spaarder kaart open om bloed drogen.
Opmerking: Alle deeltjes in de lucht of stof tijdens deze drogen stap heeft geen invloed op van downstream toepassingen. - De kaart bij kamertemperatuur bewaren in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik.
2. DNA-extractie vanaf DBS volgens het DNA extractie Kit gegevensblad (sectie voor gedroogde bloed vlekken)
-
Bereiding van de monsters
- Gebruik 3 gedroogd bloed vlekken van de kaart. Snijd elk van de gedroogde bloed vlekken van de kaart en scheiden van de kaart met een pincet. Snijd de gescheiden gedroogd bloed vlekken in kleine stukjes (diameter van ongeveer 1 mm).
- Leg de kleine stukjes in een centrifugebuis 1,5 mL.
-
Monster spijsvertering
- Voeg 180 µL van lysis buffer 1 geleverd in de kit (Tabel van materialen) aan de buis. Voeg 20 µL van proteïnase K. Meng geen lysis-buffermengsel 1 met proteïnase k voordat pipetteren in de 1,5 mL-buis met bloed bevlekte kaart. Meng door vortexing.
- Plaats de buis in een thermoincubator en Incubeer bij 56 ° C gedurende 60 min. Als de thermoincubator niet is uitgerust met een shaker, vortex het monster elke 10-15 min voor ten minste 10 s, verzorgen niet te laat de temperatuur van het monster verlagen. Kort centrifugeren de buizen druppels om uit te verwijderen het deksel.
-
Wassen van stap
- Voeg 200 µL van lysis buffer 2 (Tabel van materialen) en vortex voor 10 s.
- Plaats de buizen in een thermomixer of verwarmde orbitale incubator en Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Als de thermoincubator niet met een shaker uitgerust is, vortex de monsters eenmaal voor ten minste 10 s, verzorgen niet te laat de temperatuur van de monsters afnemen.
- Herhaal stap 2.3.1. Breng de 400 µL van lysate uit de buis 1,5 mL elutie kolom (Tabel van materialen). Centrifugeer de kolom bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
- Plaats van de kolom-elutie in een nieuwe 2 mL collectie buis en negeren oude.
- Voeg 500 µL van was buffer 1 (Tabel van materialen) en centrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
- Plaats van de kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en gooi oude.
- Voeg 500 µL van was buffer 2 (Tabel van materialen) en centrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
- Plaats van de kolom in een nieuwe 2 mL collectie buis en gooi oude.
- Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten te drogen van het membraan.
-
Elutie stap
- Plaats van de kolom in een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis en gooi de collectie buis.
- Plaats 50 µL van gedistilleerd water in het midden van het membraan. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de buis bij 20.000 x g gedurende 1 min. verzamelen het eluaat en plaats deze weer in het midden van het membraan.
- Centrifugeer de buis bij 20.000 x g gedurende 1 min. Gooi het membraan.
- Het meten van de concentratie van de DNA met een spectrofotometer.
- Winkel DNA bij-20 ° C tot gebruik.
Opmerking: DNA geëxtraheerd uit DBS kan worden gebruikt voor het uitvoeren van diverse analyses uitgevoerd, zoals de SNP evaluatie door Real Time PCR of DNA Sanger sequentiebepaling.
3. serum opslag voor DSS
-
Bloed monster collectie
- Verzamelen 7 mL van perifeer bloedmonster in een tube van 7 mL zonder EDTA. Laat het bloedmonster te coaguleren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- De patiënt codenummer op de rechter benedenhoek van de Spaarder kaart schrijven.
- Centrifugeer het bloedmonster bij 980 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Bewaar serum als DSS zo spoedig mogelijk en binnen 8 uur. - Verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de buis voorzichtig en overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL. Zorgvuldig resuspendeer de bloed met een 5 mL-pipet.
-
Serum spotten in DSS
- Pipetteer af en breng een plek van serum (50 µL) op de kaart van de spaarder. Herhaal deze stap als u wilt dat een totaal van 3 – 5 bloed vlekken.
Opmerking: Wees zeer voorzichtig te precies 50 µL van de serum Pipetteer in elke vlek. Serum moet het niet verder dan uit de onderbroken lijn van de kaart. - Laat de DSS aan droge overnachting bij kamertemperatuur. Laat de cover van de Spaarder kaart open om bloed drogen.
- De kaart bij kamertemperatuur bewaren in een plastic zak met droogmiddel tot gebruik. Als de opslag langer dan 14 dagen is, slaat u de kaart bij-20 ° C.
- Pipetteer af en breng een plek van serum (50 µL) op de kaart van de spaarder. Herhaal deze stap als u wilt dat een totaal van 3 – 5 bloed vlekken.
4. ELISA Assay vanaf DSS
-
Elueer eiwit van DSS.
- Ontdooi een DSS voor elk monster indien nodig. DSS snijd in kleine stukjes (ongeveer 1 mm in diameter). Zet de stukken in een tube 1,5 mL met 400 µL van PBS.
- Schud de monsters 's nachts bij 4 ° C.
Opmerking: Schud ze bij een lage intensiteit. PBS moet de cover van de buis niet nat. tijdens het schudden.
- Gebruik het eluaat eiwit als een serummonster voor secreted eiwit/groei factoranalyse volgens de instructies van de kit van ELISA, na passende verdunningen.
Opmerking: Deze procedure werkt goed voor DBP detectie9. Voor andere ELISA-testen, kan een stap van optimalisatie nodig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wij maakte gebruik van de DBS en DSS procedures voor het opslaan van bloed en serum bij kamertemperatuur zonder de kwaliteit van het biologisch materiaal te beïnvloeden. Figuur 1 toont een voorbeeld van de eiwit-kaart spaarder zonder bloed en na het verzamelen van bloed. Om te bevestigen dat de opslag op filterpapier en de procedure voor het bloed Elueer niet met monster kwaliteit interfereert, we een vergelijking uitgevoerd met standaard opslagmethoden. We hebben opgehaald DNA van 3 gecompenseerde monsters van volbloed verzameld in een tube van 2 mL of opgeslagen als DBS, zoals vermeld in de sectie Protocol. Vijf SNPs werden geanalyseerd door real-time PCR. De gegevens die zijn verkregen voor gecompenseerde monsters waren 100% concordant.
Met betrekking tot de analyses ELISA, we opgeslagen 8 monsters van serum verzameld in een tube 2 mL (en onmiddellijk bij-80 ° C) en DSS (opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende één week, en vervolgens bij-20 ° C). Wij geëlueerd eiwitten van DSS, zoals beschreven in de sectie Protocol, en vervolgens uitgevoerd ELISA volgens fabrikant gegevensblad voor DBP voor de 8 monsters. Resultaten zijn weergegeven in tabel 1. De variatiecoëfficiënt (CV) tussen de gecompenseerde monsters varieerde van 2% naar 24%. De gemiddelde CV was 9,6%.
Afbeelding 1: voorbeeld van DBS vóór en na de bloedinzameling. (A) eiwit saver kaart. (B) eiwit saver kaart na bloedmonsters. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| DBP (µg/mL) | |||
| Monsters | Serum (st) | DSS | AVK % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
Tabel 1: DPB niveaus in gecompenseerde DSS en serummonsters. DBP niveaus geanalyseerd door analyse ELISA. CV is de coëfficiënt van de variatie tussen de 2 verkregen waarden berekend. Het percentage van de CV wordt als volgt berekend: ((DSS value-Serum value)/DSS waarde) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol onderzoekt de mogelijkheden voor het opslaan van bloed en serum op filterpapier wanneer de labs niet hebben het personeel of de infrastructuur die nodig is voor de juiste afhandeling van bloedmonsters. In het bijzonder, volledig bloed of serum verzameld in standaard buizen of door vinger-lul kan worden opgeslagen met behulp van deze methode en er is geen behoefte om te bevriezen van monsters bij-20 ° C of -80 ° C onmiddellijk na de bloedinzameling. DBS/DSS kan blijven tot 14 dagen zonder enige verandering in bloedserum/integriteit bij kamertemperatuur. Een cruciale kwestie voor de opslag is de aanwezigheid van vocht dat is van invloed op de eigenschappen van biologisch materiaal meer dan temperatuur. Dit probleem kan worden vermeden door het gebruik van plastic zakken met droogmiddel. Vocht wordt een probleem tijdens de opslag, wanneer de kaarten zijn binnen de plastic zakken. Problemen die voortkomen uit deeltjes in de lucht/druppels/stof of vocht werden niet waargenomen tijdens de nachtelijke incubatie10. We vroeger filterpapier voor het opslaan van bloed en serum in een studie van biologische markers in Italiaanse en Afrikaanse cohorten11. We DNA-extractie van DBS geoptimaliseerd en een aantal SNPs in beide geval serie geanalyseerd. Als we ook geïnteresseerd waren in de evaluatie van eiwitniveaus, geoptimaliseerd we een methode om eiwitten van DSS Elueer om uit te voeren van de ELISA testen. Serum opslag in DSS voor ELISA is gevoeliger dan volbloed opslag voor kwalitatieve analyses, omdat onderzoekers van het laboratorium moet Pipetteer precies dezelfde hoeveelheid serum in alle monsters. Als pipetteren niet juist is, zal stroomafwaarts analyses worden aangetast. Terwijl de DNA-extractiemethode kan worden toegepast op andere moleculaire analyses, moet de eiwit-procedure worden geoptimaliseerd in gecompenseerde monsters voor elke nieuwe cytokine/uitgescheiden factor onderzocht. Het is belangrijk aan DSS in zeer kleine stukjes gesneden en de stukken van de kaart grondig met PBS NAT tijdens de nachtelijke incubatie om ervoor te zorgen efficiënte eiwit elutie. Dit is een meer delicate stap dan die van bloed elutie omdat ELISA een kwantitatieve evaluatie is.
In de afgelopen jaren heeft de aanpak van deze opslag wijd gebruikt voor verschillende toepassingen, variërend van (zoals beschreven in dit protocol) van de moleculaire biologie tot en met12,13van de analyse van de eiwitten. In het bijzonder goede kwaliteit massa resultaten vanaf serum gespot in saver kaarten zijn gemeld14, bevestiging van de hoge flexibiliteit en betrouwbaarheid van de methode.
Onze resultaten, in overeenstemming met de literatuur, markeert u het nut van het opslaan van monsters als DBS en bevestigen van de betrouwbaarheid van deze procedure met betrekking tot standaard opslagmethoden. Wij vorige resultaten bevestigd en onderstreept de mogelijkheid van het optimaliseren van een ELISA-test met behulp van het samen met onze opslagmethoden. Dankzij zijn eenvoud, kunnen ontwikkelingslanden ook bijdragen aan kankeronderzoek. Bijvoorbeeld, als de meerderheid van de studies over Afrikanen zijn uitgevoerd op Afro-Amerikanen, zijn zeer weinig gegevens beschikbaar op inheemse Afrikanen9. Het gebruik van DBS kan helpen om deze kloof te overbruggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
