Secas de sangue e soro manchas como uma ferramenta útil para o armazenamento de amostra avaliar biomarcadores de câncer
Summary
Este protocolo descreve um método simples e útil para armazenar o sangue periférico e soro/plasma para análises a jusante, tais como avaliação de nucleotídeo único (SNP) de polimorfismo e ensaio de ELISA.
Abstract
Qualidade de amostra de sangue é essencial para garantir a precisa análises a jusante como real-time PCR ou ELISA. Armazenamento correto de materiais biológicos é o ponto de partida para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis. Todas as amostras devem ser tratadas da mesma forma de coleta de sangue para armazenamento. Dependendo de análises a realizar, amostras de soro e sangue total devem ser armazenadas a-20 ° C ou -80 ° C até o uso. Amostras de sangue/soro também devem ser aliquotadas para evitar múltiplas de congelamento-descongelamento. Outra questão importante é as condições da amostra durante o transporte de um laboratório para outro. Se o gelo seco não está disponível ou o carregamento demora mais do que alguns dias, são necessárias abordagens alternativas. Uma opção é usar papel de filtro para coleta de sangue. Aqui, propomos um método de sangue e coleta de amostra de soro que aproveita seca manchas de sangue (DBS) e seca manchas de soro (DSS). Nós desenvolvemos o procedimento para extrair DNA de DBS para a avaliação a jusante de alguns polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) por PCR em tempo real. Nós também Aperfeiçoamos um ensaio de ELISA, a partir de proteínas eluídas da DSS. Esse método pode ser usado com outros ensaios de ELISA ou procedimentos de avaliação de proteínas.
Introduction
O principal objetivo da pesquisa em biomarcadores de câncer é a identificação de novos parâmetros biológicos que pode ser usada para diagnóstico, prognóstico de pacientes prever e para determinar se um paciente responderá a um tratamento específico. Esta área de investigação é fundamental para a descoberta de tratamentos inovadores e desempenha um papel fundamental no tratamento sob medido.
Os procedimentos realizados durante cada passo do biomarcador identificação e validação devem ser confiável e reprodutível. Uma pedra fundamental para o sucesso da investigação de translação é o correto armazenamento de amostras biológicas como sangue e soro. Este é o primeiro passo para obtenção de material biológico de alta qualidade que pode ser usado para realizar experimentos de biologia molecular ou ensaios da proteína.
Estudos multicêntricos são muitas vezes necessários para recrutar suficiente pacientes para obter dados robustos. Nem todos os institutos são capazes de armazenar amostras a-80 ° C ou para enviar amostras para outros centros internacionais em gelo seco. O uso de papel de filtro para coleta de sangue é um método simples para armazenar sangue e soro e não exige o imediato congelamento de amostras1,2. Uma gota de sangue ou soro pode ser vista no papel, deixada para secar durante a noite e então armazenado por até 14 dias em temperatura ambiente1,2. Isto dá a investigadores tempo para enviar as amostras de outros laboratórios. O uso de sangue seco manchas (DBS) e manchas secas soro (DSS), portanto, poderiam simplificar a colaboração entre os institutos em países desenvolvidos e em desenvolvimento.
Dada a sua facilidade de uso, amostragem de DBS é amplamente utilizada em diversos tipos de ensaios para análises a jusante serológicas ou genéticas. Por exemplo, no passado, DBS frequentemente foram usados para HIV triagem em países em desenvolvimento1,2,3,4,5. Outra vantagem deste método de armazenamento é que podem ser colhidas amostras de sangue do dedo-picas, permitindo seu uso para o recém-nascido, triagem de testes 6,7,8. Amostra de fácil manuseio e transporte são ainda mais vantagens de DBS, especialmente para amostras coletadas em locais remotos onde não há nenhum equipamento de laboratório. Em uma publicação anterior, usamos DBS e DSS para testar a vitamina D e vitamina D (DBP) proteína em uma série de pacientes africanos e caucasianos9. Nossos colegas africanas não foram capazes de obter gelo seco. Para comparar os marcadores biológicos para entender as diferenças na via da vitamina D, entre as duas populações étnicas, melhorámos ainda mais o procedimento usando combinadas amostras armazenadas sob condições normais e em papel de filtro. Depois de otimizar o procedimento DBS/DSS, fomos capazes de analisar DBP e vitamina D no soro em ambas as coortes. Avaliamos também um número de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) após a extração de DNA do sangue inteiro para brancos e de DBS para africanos9. O presente protocolo permite que as amostras de sangue de alta qualidade para ser armazenado em temperatura ambiente, sem afetar diferentes tipos de análises a jusante que variam de biologia molecular para ensaios de ELISA. É recomendável para uso gerenciar materiais biológicos em estudos multicêntricos ou para centros que não têm instalações para as condições de armazenamento padrão. O protocolo seguinte representa o culminar destes procedimentos otimizados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo investiga o potencial para armazenamento de sangue e soro em papel de filtro quando os laboratórios não têm o pessoal ou as infra-estruturas necessárias para a manipulação correta de amostras de sangue. Em particular, sangue total ou soro coletado em tubos padrão ou por picada do dedo pode ser armazenado usando este método e não há nenhuma necessidade para congelar amostras a-20 ° C ou -80 ° C imediatamente após a coleta de sangue. DBS/DSS podem permanecer em temperatura ambiente por até 14 d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
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