Sang et sérum taches séchées comme un outil utile pour la conservation de l’échantillon afin d’évaluer les biomarqueurs du Cancer
Summary
Ce protocole décrit une méthode simple et utile pour stocker le sang périphérique et le sérum/plasma pour des analyses en aval comme single nucleotide polymorphisme (SNP) évaluation et analyse d’ELISA.
Abstract
Qualité d’échantillon de sang est essentielle pour assurer des analyses précises en aval comme la PCR en temps réel ou de ELISA. Un stockage correct des matériaux biologiques est le point de départ pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Tous les échantillons doivent être traités de la même manière de collecte de sang au stockage. Selon les analyses à effectuer, le sang et les échantillons de sérum doivent être conservées à-20 ° C ou à-80 ° C jusqu’à l’utilisation. Des échantillons de sérum sanguin/devraient également être aliquotés pour éviter les multiples de gel-dégel. Une autre question importante est les conditions de l’échantillon lors de l’expédition d’un laboratoire à l’autre. Si la glace sèche n’est pas disponible ou l’expédition prend plue que quelques jours, autres approches sont nécessaires. Une option consiste à utiliser le papier filtre pour la collecte de sang. Ici, nous proposons une méthode pour le sang et le prélèvement d’échantillons de sérum qui profite du sang séché (DBS) et séché de sérum (DSS). Nous avons développé la procédure pour extraire l’ADN de DBS pour l’évaluation en aval de quelques simples de nucléotide simple (SNP) par PCR en temps réel. Nous avons également optimisé un test ELISA à partir de protéines éluées de DSS. Cette méthode peut être utilisée avec d’autres tests ELISA ou les procédures d’évaluation des protéines.
Introduction
L’objectif principal de la recherche sur les biomarqueurs du cancer est l’identification de nouveaux paramètres biologiques qui peut être utilisé pour le diagnostic, pour prédire pronostic patient et pour déterminer si un patient va réagir à un traitement spécifique. Ce domaine de recherche est fondamental pour la découverte de traitements novateurs contre le cancer et joue un rôle clé dans le traitement sur mesure.
Les procédures effectuées au cours de chaque étape de l’identification de biomarqueurs et de validation doivent être fiables et reproductibles. Des pierres angulaires du succès de la recherche translationnelle sont le stockage correct des échantillons biologiques comme le sang et le sérum. Il s’agit de la première étape vers l’obtention de matériel biologique de qualité qui peut être utilisé pour effectuer des expériences de biologie moléculaire ou analyses de protéines.
Études multicentriques sont souvent nécessaires pour recruter suffisamment patients pour obtenir des données fiables. Pas tous les instituts sont en mesure de conserver les échantillons à-80 ° C ou à envoyer des échantillons d’autres centres internationaux en glace sèche. L’utilisation de papier filtre pour la collecte de sang est une méthode simple pour le stockage de sérum et sang et ne nécessite pas le gel immédiat des échantillons1,2. Une goutte de sang ou de sérum peut être repérée sur le papier, laissé sécher pendant la nuit et puis stocké pendant jusqu’à 14 jours à température ambiante1,2. Cela donne des chercheurs de temps pour envoyer les échantillons d’autres laboratoires. L’utilisation de sang séché taches (DBS) et taches séchées de sérum (DSS) pourraient ainsi simplifier la collaboration entre les instituts dans les pays développés et en développement.
Compte tenu de sa facilité d’utilisation, l’échantillonnage DBS est largement utilisé dans plusieurs types d’analyses pour des analyses sérologiques ou génétiques en aval. Par exemple, dans le passé, la DBS étaient fréquemment utilisés pour le VIH dans les pays en développement1,2,3,4,5. Un autre avantage de cette méthode de stockage est peuvent percevoir des échantillons de sang du doigt-pique, ce qui permet son utilisation pour le dépistage des essais 6,7,8. Exemple simple de manutention et de transport sont a d’autres avantages de DBS, surtout pour les échantillons prélevés dans les sites distants où il n’y a aucun équipement de laboratoire. Dans une publication précédente, nous avons utilisé DBS et DSS pour tester la vitamine D et vitamine D protéine de liaison (DBP) dans une série de patients caucasiens et africaine9. Nos collègues africains n’étaient pas en mesure d’obtenir de la glace sèche. Pour comparer les marqueurs biologiques pour comprendre les différences dans la voie de la vitamine D entre les deux populations ethniques, nous avons encore amélioré la procédure en utilisant des échantillons appariés, stockés dans des conditions normales et sur papier filtre. Après avoir optimisé la procédure DBS/DSS, nous avons pu analyser DBP et vitamine D dans le sérum de patients dans les deux cohortes. Nous avons également évalué un certain nombre de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) après extraction de l’ADN du sang pour les personnes de race blanche et de DBS pour africains9. Le présent protocole permet des échantillons de sang de haute qualité doivent être conservés à température ambiante sans affecter les différents types d’analyses en aval allant de la biologie moléculaire aux tests ELISA. Il est recommandé pour une utilisation gérer les matières biologiques dans des études multicentriques ou pour les centres qui n’ont pas d’installations pour des conditions de stockage standard. Le protocole suivant représente l’aboutissement de ces procédures optimisées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole examine le potentiel pour le stockage de sérum et sang sur un papier filtre lorsque les laboratoires n’ont pas le personnel ou les infrastructures nécessaires pour la manipulation correcte des échantillons de sang. En particulier, le sang ou le sérum recueillis dans des tubes standards ou par piqûre doigt peut être stockée à l’aide de cette méthode et il n’y a pas besoin de congeler les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C immédiatement après le prélèvement de sang. DBS/DSS peut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Gráinne Tierney pour aide à la rédaction.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
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