Сушеные крови и сыворотке пятна как полезный инструмент для хранения проб для оценки рака Биомаркеры
Summary
Этот протокол описывает простой и полезный метод для хранения периферической крови и сыворотки/плазмы для вниз по течению анализы единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм оценки и анализа ELISA.
Abstract
Качество образца крови имеет решающее значение для обеспечения точной течению анализы как реальном масштабе времени PCR или ELISA. Правильное хранение биологических материалов является отправной точкой для достижения надежных и воспроизводимых результатов. Все образцы должны рассматриваться таким же образом от крови коллекции для хранения. В зависимости от выполняемых анализов цельной крови и сыворотки образцы должны храниться при-20 ° C или ° C-80 до использования. В образцах сыворотки крови также должно быть aliquoted, чтобы избежать нескольких замораживания оттаивания. Еще одним важным вопросом является пример условий во время транспортировки из одной лаборатории в другую. Если сухой лед не доступен или отгрузки занимает больше времени, чем несколько дней, необходимы альтернативные подходы. Один из вариантов заключается в использовании фильтр бумага для сбора крови. Здесь мы предлагаем метод для крови и проб сыворотки, которая использует высушенные мазки крови (DBS) и сушат пятна сыворотки (DSS). Мы разработали процедуры для извлечения ДНК из DBS течению оценки некоторых единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП), ПЦР в реальном времени. Мы также оптимизировали пробирного ELISA, начиная от белков этого eluted от DSS. Этот метод может использоваться с другими ELISA assays или процедур оценки белков.
Introduction
Основная цель исследования в биомаркеров рака является выявление новых биологических параметров, которые могут использоваться для диагностики, прогнозирования прогноз пациента и для определения, будет ли отвечать на конкретные лечения пациента. Эта область исследований является основополагающим для открытия инновационных рака и играет ключевую роль в заказ лечения.
Процедуры, проведенных во время каждого шага биомаркер идентификации и проверки должны быть надежных и воспроизводимых. Краеугольным камнем успеха трансляционного исследования является правильным хранением биологических образцов крови и сыворотки. Это первый шаг на пути получения высокого качества биологический материал, который может использоваться для выполнения экспериментов молекулярной биологии или анализы белка.
Многоцентровых исследований часто необходимо набрать достаточное количество пациентов для получения надежных данных. Не все институты способны хранить образцы на-80 ° C или отправить образцы в других международных центров в сухой лед. Использование фильтра бумаги для сбора крови представляет собой простой метод для хранения крови и сыворотки и не требуется немедленное замораживание образцов1,2. Капля крови или сыворотки может быть выставлен на бумаге, оставить для высыхания на ночь и затем сохраняется на срок до 14 дней при комнатной температуре1,2. Это дает исследователям время направить образцы в других лабораториях. Использование засохшей крови пятна (DBS) и сушеная сыворотка пятна (DSS) может таким образом упростить сотрудничество между институтами в развитых и развивающихся странах.
Учитывая его простоту использования, DBS выборки широко используется в нескольких видов анализов для серологических или генетических анализов вниз по течению. Например в прошлом, DBS часто используются для скрининга в развивающихся странах1,2,3,,45ВИЧ. Еще одним преимуществом данного метода хранения является, что образцы крови могут быть собраны из пальца уколов, что позволяет использовать его для новорожденных, скрининг тесты 6,,78. Простой пример обработки и транспортировки являются дополнительные преимущества DBS, особенно для образцов, собранных в удаленных сайтах там, где нет лабораторное оборудование. В предыдущей публикации мы использовали DBS и DSS для тестирования витамина D и белок, связывающий витамина D (БРФ) в серии Кавказского региона и Африки пациентов9. Наши африканские коллеги не смогли получить сухой лед. Чтобы сравнить биологических маркеров, чтобы понять различия в витамин D пути между двумя этническими народностями, мы усовершенствовать процедуру, с помощью образцов хранятся в стандартных условиях и на фильтровальной бумаге. После оптимизации процедуры DBS/DSS, мы смогли проанализировать DBP и витамина D в сыворотке пациента в обеих когортах. Мы также оценили количество единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) после экстракции ДНК из цельной крови для кавказцев и DBS для африканцев9. Настоящий Протокол позволяет высокое качество образцов крови должны храниться при комнатной температуре, не затрагивая различные типы течению анализов, начиная от молекулярной биологии ELISA assays. Рекомендуется для использования для управления биологическими материалами в многоцентровых исследованиях или для центров, которые не имеют возможностей для хранения стандартных условий. Следующий протокол представляет собой кульминацию этих оптимизации процедур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол исследует потенциал для хранения крови и сыворотки на фильтровальной бумаге, когда лаборатории не имеют сотрудников или инфраструктуры, необходимой для правильной обработки образцов крови. В частности цельной крови или сыворотки, собранных в стандартных труб или палец ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Грайне Тирни для редакционной помощи.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
