Summary
このプロトコルでは、末梢血および単一ヌクレオチド多型 (SNP) の評価や ELISA アッセイなどの下流解析の血清/血漿を格納する簡単で便利な方法について説明します。
Abstract
血液サンプルの品質は、リアルタイム PCR や ELISA など正確な下流解析のために重要です。生物学的材料の適切な保管は、再現性と信頼性の高い結果を達成するための開始点です。すべてのサンプルは、ストレージに採血から同じ方法で扱われるべき。によって実行される解析、全血、血清使用まで-80 ° C または-20 ° C で保存される必要があります。血液/血清サンプルは、複数の凍結を避けるために検体もあります。もう一つの重要な問題は 1 つの研究所からの出荷時にサンプル条件です。ドライアイスは出荷が数日以上かかる場合、代替的なアプローチが必要です。1 つのオプションは、採血用ろ紙を使用することです。ここでの血のための手法を提案、血清サンプル コレクションを利用した乾燥血液スポット (DBS) 血清スポット (DSS) を乾燥します。リアルタイム PCR によるいくつかの単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) の下流の評価のための DBS から DNA を抽出するプロシージャを開発しました。我々 は、DSS から溶出蛋白質から ELISA アッセイも最適化。このメソッドは、他の ELISA アッセイまたは蛋白質の評価の手順で使用できます。
Introduction
がんバイオ マーカーを研究の主な目的は、診断、予後予測、および患者が特定の治療に応答するかどうかを決定するために使用できる新しい生物学的パラメーターの id です。本研究領域は、革新的ながん治療法の発見のための基礎で合わせた治療で重要な役割を果たしています。
バイオ マーカーの同定と検証の各段階を実施は、信頼性と再現性のある必要があります。トランスレーショナル ・ リサーチの成功の礎は、血液や血清などの生体サンプルの適切なストレージです。これは、分子生物学実験や蛋白質の試金の実行するために使用できる高品質の生物材料の取得への第一歩です。
多施設共同研究が堅牢なデータを取得する十分な患者を募集する必要多くの場合です。すべての機関は-80 ° c のサンプルを格納するまたはドライアイスの他の国際センターにサンプルを送信することができます。採血用ろ紙を血液や血清を保存する簡単な方法し、サンプル1,2の即時凍結を必要としません。血液や血清のドロップは、一晩乾燥して左右の部屋の温度1,2では、14 日間保存されます紙の上に発見できます。これは研究者に他の研究室にサンプルを送信する時間を与えます。乾燥血液の使用スポット (DBS) と乾燥血清スポット (DSS) したがって先進国と発展途上国の機関間のコラボレーションを単純化します。
その使いやすさを考えると、DBS サンプリングを試金のいくつかの種類の血清学的または遺伝的下流解析の使用広く。たとえば、過去には、DBS 頻繁 HIV 発展途上国1,2,3,4、5のスクリーニングの使用されました。このストレージ メソッドのもう一つの利点は指呵責、新生児スクリーニング テスト6,7,8での使用ができ採取血液サンプルすることができます。簡単な検体の取扱い、輸送、さらにリモート サイトに収集されたサンプルのために特に DBS の利点実験装置がないです。前の文書で白人とアフリカの患者9一連のビタミン D とビタミン D 結合タンパク質 (DBP) をテストする DBS と DSS を使いました。アフリカの仲間たちは、ドライアイスを取得することができませんでした。ビタミン D 経路の 2 つの民族集団の間の違いを理解する生物学的マーカーを比較して一致したサンプルを標準的な条件の下で、フィルター紙の上を格納を使用してプロシージャをさらにアップ。DBS/DSS 手順を最適化した後 DBP と両方のコホートで患者血清中のビタミン D 分析することができました。また白人の全血およびアフリカ人9DB からの DNA の抽出後単一のヌクレオチドの多形 (SNPs) の数を調べた。この議定書は、ELISA の試金に分子生物学に至る下流解析の種類に影響を与えることがなく室温で保存する高品質な血液サンプルを許可します。通常の保管状態の施設を持っていないセンター、多施設共同研究で生体を管理するために使用をお勧めします。次のプロトコルの最適化手順の集大成を表します。
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Protocol
末梢血および血清が収集および健康なドナーと研究に参加する書面による同意を得た患者から保存します。研究プロトコルは 1964 のヘルシンキ宣言に敷設された倫理基準に従ってローカル倫理委員会で承認されました。
1 DBS 血液貯蔵
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血液検体の採取
- エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5.4 mg 3 mL 管末梢血サンプル 3 mL を収集します。
注: は、DBS、できるだけ早くとして、8 時間以内に末梢血を保存します。 - 節約カードの右下隅の患者番号を記述します。
- 5 mL ピペットで血を慎重に再懸濁します。
- エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 5.4 mg 3 mL 管末梢血サンプル 3 mL を収集します。
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DBS のスポッティング血
- ピペットし、50-200 μ L チップ セーバー カード (材料表) に血液 (50 μ L) の 1 つのスポットを転送します。
- 1.2.1 手順を繰り返します。3-5 血点の合計を持っています。古いチップを破棄し、分注各血の新しい 1 つを取る。
- 直射日光を避け、開いての非吸収表面上水平位置に室温で一晩乾燥して DBS を残します。節約カードのカバーを空けて血液の乾燥を容易にします。
注: この乾燥のステップの間にほこりや空気のすべての粒子は、下流のアプリケーションには影響しません。 - ビニール袋に乾燥剤を使用するまで室温でカードを格納します。
2. DNA 抽出 DNA 抽出キット データシート (乾燥血液スポットのセクション) によると DBS から始まって
-
サンプル準備
- カードからの 3 つの乾燥血液スポットを使用します。各カードから乾燥血液スポットをカット、ピンセットでカードからそれらを区切ります。小さな断片 (直径約 1 mm) に区切られた乾燥血液スポットをカットします。
- 1.5 mL 遠心チューブに小さな断片を配置します。
-
サンプル消化
- 換散バッファー チューブ キット (材料表) で提供される 1 の 180 μ L を追加します。プロテイナーゼ K の 20 μ L を追加します。プロティナーゼ k のカードを発見血で 1.5 mL チューブに分注する前に 1 の換散バッファーを混在させないでください。ボルテックスでミックスします。
- Thermoincubator でチューブを置き、56 ° C, 60 分インキュベートします。Thermoincubator のシェーカー、渦、サンプルが搭載されていないかどうかは、少なくとも 10 の 10-15 分毎 s、サンプルの温度が低下しないように世話します。簡単に遠心分離機管の蓋から滴を削除します。
-
洗浄ステップ
- 200 μ L の換散バッファー 2 (材料表) と 10 の渦を追加 s。
- Thermomixer または温水軌道インキュベーターにチューブを置き、70 の ° C で 10 分間インキュベートします。シェーカー、thermoincubator が付いていない場合渦、少なくとも 10 回のサンプル s、サンプルの温度が低下しないように世話します。
- 2.3.1 手順を繰り返します。ライセートの 400 μ L を 1.5 mL チューブから溶出の列 (テーブルの材料) に移転します。1 分間 6,000 x g で列を遠心します。
- 新しい 2 mL のコレクションの管に溶出列を置き、古い 1 つを破棄します。
- 1 分間 6,000 x g で 500 μ L の洗浄バッファー 1 (材料表) と遠心分離機を追加します。
- 新しい 2 mL のコレクションの管に列を置き、古い 1 つを破棄します。
- 1 分間 6,000 x g で 500 μ L の洗浄バッファー 2 (材料表) と遠心分離機を追加します。
- 新しい 2 mL のコレクションの管に列を置き、古い 1 つを破棄します。
- 膜を乾燥する 3 分 20,000 × g で遠心分離機します。
-
溶出のステップ
- 新しい 1.5 mL 遠心チューブに列を置き、コレクション チューブを破棄します。
- 膜の中央に蒸留水の場所 50 μ L。室温で 10 分間インキュベートします。
- 20,000 × gで 1 分間収集管溶出液を遠心し、膜の中央に配置し直します。
- 1 分の 20,000 × gで遠心分離機は、膜を破棄します。
- 分光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。
- 使用するまで-20 ° C で DNA の店。
メモ: DB から抽出した DNA は SNP 評価などいくつかの解析を実行するリアルタイム PCR や DNA サンガーのシーケンスで使用できます。
3. 血清用の DSS
-
血液検体の採取
- EDTA なし 7 mL チューブで末梢血サンプル 7 mL を収集します。室温で 30 分間凝固血液サンプルを残します。
- 節約カードの右下隅の患者番号を記述します。
- 室温で 15 分間 980 x gで血液サンプルを遠心します。
注: は、DSS、できるだけ早くとして、8 時間以内に血清を保存します。 - 慎重にチューブから上澄みを除去し、新しい 15 mL チューブにそれを転送します。5 mL ピペットで血を慎重に再懸濁します。
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DSS のスポッティング血清
- ピペットし、セーバー カードに血清 (50 μ L) の 1 つのスポットを転送します。この手順では、3-5 血点の合計を持っています。
注: は、各スポットに正確に 50 μ L の血清をピペットに非常に注意します。血清はカードの破線からを超えてはなりません。 - 室温で一晩乾燥に DSS を残します。節約カードのカバーを空けて血液の乾燥を容易にします。
- ビニール袋に乾燥剤を使用するまで室温でカードを格納します。ストレージが 14 日以上の場合は、-20 ° C でカードを格納します。
- ピペットし、セーバー カードに血清 (50 μ L) の 1 つのスポットを転送します。この手順では、3-5 血点の合計を持っています。
4. ELISA アッセイ DSS から始まって
-
DSS からタンパク質を溶出します。
- 必要な場合は、各サンプルの DSS を解凍します。小さな断片 (直径約 1 mm) に DSS をカットします。作品を 400 μ L の PBS を 1.5 mL チューブに入れます。
- 4 ° C で一晩サンプルを振る
注: は、低強度でそれらを振る。PBS は、加振時管のカバーを濡れていないする必要があります。
- 適切な希釈後血清サンプルとして ELISA キットの指示に従って分泌タンパク質/成長因子分析のための蛋白質の溶出液を使用します。
注: この手順は、DBP 検出9に適しています。他の ELISA の試金、最適化の手順を必要ことがあります。
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Representative Results
我々 は生物材料の品質に影響を与えずに血液と室温で血清を保存する DBS と DSS のプロシージャの利点を取った。図 1は、蛋白質カード セーバー血液なしと採血後の例を示します。ろ紙上のストレージと血を溶出する手順をサンプルの質に干渉しないことを確認するために、標準のストレージ メソッドで比較を行った。プロトコル セクションで報告された、我々 は全血 2 mL チューブに収集または DBS、として保存される 3 一致するサンプルから DNA を抽出しました。5 つの Snp は、リアルタイム PCR によって分析されました。一致した試料について得られたデータ 100% 一致であった。
ELISA 解析に関して我々 保存血清 2 mL 管の収集の 8 サンプル (およびすぐに-80 ° C で保存) と DSS (常温 1 週間し、-20 ° C で保存されている)。我々 はプロトコル セクションの説明に従って、DSS からタンパク質を溶出し、メーカーのデータシートによると 8 サンプルの DBP の ELISA を行いました。結果は表 1のとおりです。2% 〜 24% 一致するサンプル間変動 (CV) の係数。平均 CV 9.6% であった。
図 1: DBS 血のコレクションの前後の例です。(A) タンパク質節約カード。(B) 採血後タンパク質節約カード。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| DBP (μ g/mL) | |||
| サンプル | 血清 (st) | DSS | CV % |
| 1 | 66.47 | 65.28 | 2 |
| 2 | 213.31 | 216.51 | 1 |
| 3 | 164.96 | 145.21 | 14 |
| 5 | 109.81 | 120.28 | 9 |
| 6 | 162.70 | 130.60 | 24 |
| 7 | 124.63 | 117.13 | 6 |
| 8 | 149.47 | 132.69 | 12 |
表 1: 一致する DSS および血清試料中の DPB レベル。ELISA の試金によって分析 DBP レベル。CV は 2 得られた値と計算され、変動係数です。CV パーセンテージは次のように計算されます: ((DSS value-Serum value)/DSS 値) × 100%。
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Discussion
このプロトコルは、ラボ スタッフや血液サンプルの適切な処理に必要なインフラストラクチャを持たないときろ紙上血液及び血清を保存するための可能性を追究します。特に、このメソッドを使用して、全血または血清標準管または指刺すによって収集を格納できるし、採血後すぐに-20 ° C または-80 ° C でサンプルを凍結する必要はありません。DBS/DSS は、血液/血清整合性の変更なしに 14 日間室温で保持できます。ストレージの重要な問題温度以上の生物材料の特性に影響を与える水分の存在であります。この問題は、乾燥剤をプラスチック袋を使用して回避することができます。カードがビニール袋の中に水分が貯蔵の間に問題になります。一晩培養10の間に、空気/水滴/ほこりや水分の粒子によって生じた問題は認められなかった。次に、ろ紙を使用以前イタリアとアフリカのコホート11における生物学的マーカーの研究で血液及び血清を格納します。DB からの DNA 抽出を最適化を行い、両方のケース シリーズの Snp の数。我々 がタンパク質レベルの評価に興味を持っても、ELISA アッセイを行う DSS からタンパク質を溶出する方法を最適化しました。ELISA の DSS 血清貯蔵はある研究所の研究者はすべてのサンプルで血清の正確な同じ量をピペットおく必要がありますので全血用の質的分析より敏感。ピペッティングは正確ではない、下流解析が損なわれます。DNA 抽出法は、他の分子の解析に適用できる、しながらタンパク質手順を最適化して一致したサンプル調査新しい各サイトカイン/分泌の因子でください。DSS を非常に小さな断片に切断し、効率的なタンパク質の溶出を確保するため一晩の孵化の間に PBS で徹底的にカードの部分をウェットが重要です。ELISA 定量評価であるので、これは血溶出のそれよりもより繊細なステップです。
近年、このストレージのアプローチを (ようこのプロトコルで記述されている) を分子生物学からタンパク質解析12,13に至るまでさまざまなアプリケーションに広く使用されています。特に、血清のセーバー カード発見から質量の結果がされている質の良い報告14、高い柔軟性と法の信頼性を確認することです。
文献に一致して、結果は DBS としてサンプルを格納することの有用性を強調表示し、この手続の標準的な保存方法の信頼性を確認します。我々 は以前の結果を確認、我々 のストレージ方法を使用して ELISA アッセイの最適化の可能性を強調しました。そのシンプルさのおかげで発展途上国は癌の研究にも貢献できます。たとえば、アフリカの研究の大半はアフリカ系アメリカ人に実行される、非常に少数のデータはネイティブ アフリカ9にあります。DBS の使用は、このギャップを埋めるために助けることができます。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
我々 は編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
