Tørrede blod og Serum steder som et nyttigt redskab for prøven Storage til at evaluere kræft biomarkører
Summary
Denne protokol beskriver en simpel og nyttig metode til at gemme perifert blod og serum/plasma til downstream analyser som enkelt nukleotid polymorfisme (SNP) evaluering og ELISA assay.
Abstract
Blod prøve kvalitet er afgørende at sikre nøjagtig downstream analyser såsom real-time PCR eller ELISA. Korrekt opbevaring af biologiske materialer er udgangspunktet for at opnå reproducerbare og pålidelige resultater. Alle prøver skal behandles på samme måde fra indsamling til opbevaring. Afhængigt af analyserne skal udføres, bør fuldblod og serumprøver opbevares ved-20 ° C eller-80 ° C indtil brug. Blod/serum prøver bør også være aliquoted at undgå flere fryse-optøning. Et andet vigtigt spørgsmål er de prøve betingelser under forsendelsen fra ét laboratorium til en anden. Hvis tøris er ikke tilgængelig eller leverancen tager længere tid end et par dage, er alternative tilgange nødvendige. En mulighed er at bruge filtrerpapir for blod samling. Her foreslår vi en metode for blod og serum prøve samling, der udnytter tørret blod steder (DBS) og tørret serum steder (DSS). Vi udviklede procedure for at udtrække DNA fra DBS for den efterfølgende evaluering af nogle single nucleotide polymorphisms (SNPs) af realtid PCR. Vi har også optimeret en ELISA assay startende fra proteiner elueres fra DSS. Denne metode kan bruges med andre ELISA assays eller procedurer evaluering proteiner.
Introduction
Hovedformålet med forskning i kræft biomarkører er identifikationen af nye biologiske parametre, der kan bruges til diagnosticering, forudsige patienternes prognose og for at afgøre, om en patient vil reagere på en bestemt behandling. Dette forskningsområde er grundlæggende for opdagelsen af innovative kræftbehandling og spiller en nøglerolle i skræddersyet behandling.
De procedurer, der er gennemført under hvert trin af biomarkør identifikation og validering skal være pålidelig og reproducerbar. En hjørnesten for en vellykket gennemførelse af Translationel forskning er korrekt opbevaring af biologiske prøver som blod og serum. Dette er det første skridt mod at opnå høj kvalitet biologisk materiale, der kan bruges til at udføre Molekylærbiologi eksperimenter eller protein assays.
Multicenter studier er ofte behov for at ansætte nok patienter for at få solide data. Ikke alle institutter er i stand til at gemme prøver på-80 ° C eller til at sende prøver til andre internationale centre i tøris. Brug filtrerpapir for blod samling er en simpel metode til lagring af blod og serum og kræver ikke de omgående frysning af prøver1,2. En dråbe blod eller serum kan blive opdaget på papir, overladt til tørre natten over og derefter lagret i op til 14 dage ved stuetemperatur1,2. Dette giver forskere tid til at sende prøverne til andre laboratorier. Anvendelse af tørret blod pletter (DBS) og tørrede serum steder (DSS) kunne således forenkle samarbejdet mellem institutter i udviklede lande og udviklingslande.
I betragtning af sin brugervenlighed, er DBS prøvetagning meget udbredt i flere typer af assays til serologisk eller genetisk downstream analyser. For eksempel, i fortiden, blev DBS ofte brugt til HIV screening i udviklingslandene1,2,3,4,5. En anden fordel ved denne opbevaring metode er, at blodprøver kan indsamles fra finger-pricks, således at dets anvendelse til nyfødte screening test 6,7,8. Nem prøven håndtering og transport er yderligere fordele af DBS, især for prøver, der opsamlet i fjerntliggende steder hvor der ikke er nogen laboratorieudstyr. I en tidligere publikation brugte vi DBS og DSS for at teste vitamin D og vitamin D bindende protein (DBP) i en serie af kaukasisk og afrikanske patienter9. Vores afrikanske kolleger var ikke i stand til at opnå tøris. Hvis du vil sammenligne de biologiske markører for at forstå forskellene i D-vitamin vej mellem de to etniske befolkningsgrupper, forbedret vi yderligere proceduren ved hjælp af matchede prøver opbevares under standardbetingelser og på filtrerpapir. Efter optimering DBS/DSS procedure, har vi kunnet analysere DBP og D-vitamin i patientens serum i begge årgange. Vi har også vurderet en antallet af single nucleotide polymorphisms (SNPs) efter DNA-ekstraktion fra fuldblod for kaukasiere og DBS for afrikanere9. Denne protokol tillader høj kvalitet blodprøver skal opbevares ved stuetemperatur uden at påvirke forskellige typer af downstream analyser spænder fra Molekylærbiologi til ELISA assays. Det anbefales til brug til at håndtere biologiske materialer i multicenter studier eller centre, der ikke har faciliteter for standard opbevaringsforhold. Følgende protokol repræsenterer kulminationen på disse optimeret procedurer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol undersøger mulighederne for at opbevare blod og serum på filtrerpapir, når labs ikke har personale eller infrastruktur behov for korrekt håndtering af blodprøver. Især fuldblod eller serumprøver indsamlet i standard rør eller af finger-prik kan lagres ved hjælp af denne metode, og der er ingen grund til at fryse prøver på-20 ° C eller-80 ° C umiddelbart efter samlingen blod. DBS/DSS kan forblive ved stuetemperatur i op til 14 dage uden ændring i blod/serum integritet. Et kritisk spørgsmål t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Gráinne Tierney for redaktionelle bistand.
Materials
| Whatman protein saver cards 903 Protein saver card, 100/pk | Sigma | Z761575 | Useful to store samples at room temperature for downstream analyses |
| Falcon Serological Pipettes, 5 mL | Stem cell | #38003 | |
| 50-200 µL tips | Star-Lab | S1120-8810 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 4036-3204 | |
| QIAamp DNA microkit | Qiagen | 56304 | This is a DNA extraction kit designed to isolate small quantities of DNA |
| Buffer ATL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 1 in the text | |
| Buffer AL (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Lysis Buffer 2 in the text | |
| QIAamp mini elute column | Qiagen | This is reported as column in the text | |
| AW1 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 1 IN THE TEXT | |
| AW2 (included in QIAamp DNA microkit) | Qiagen | This is reported as Wash Buffer 2 in the text | |
| Human Vitamin D BP Quantikine ELISA Kit | R&D systems | DVDBP0 |
References
- Bertagnolio, S., et al. HIV-1 drug resistance surveillance using dried whole blood spots. Antivir Ther. 12 (1), 107-113 (2007).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1631S-1636S (2001).
- Garrido, C., et al. Subtype variability, virological response and drug resistance assessed on dried blood spots collected from HIV patients on antiretroviral therapy in Angola. J Antimicrob Chemoth. 61 (3), 694-698 (2008).
- Steegen, K., et al. Feasibility of detecting human immunodeficiency virus type 1 drug resistance in DNA extracted from whole blood or dried blood spots. J Clin Microbiol. 45 (10), 3342-3351 (2007).
- Costenaro, P., et al. Viral load detection using dried blood spots in a cohort of HIV-1-infected children in Uganda: correlations with clinical and immunological criteria for treatment failure. J Clin Microbiol. 52 (7), 2665-2667 (2014).
- Gong, Z. H., Tian, G. L., Huang, Q. W., Wang, Y. M., Xu, H. P. Reduced glutathione and glutathione disulfide in the blood of glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient newborns. BMC Pediatr. 20 (17), 172 (2017).
- Lukacs, Z., Barr, M., Hamilton, J. Best practice in the measurement and interpretation of lysosomal acid lipase in dried blood spots using the inhibitor Lalistat 2. Clin Chim Acta. 471, 201-205 (2017).
- Skogstrand, P. T., Bent, N. P., Schendel, D. E., Sørensen, L. C., Hougaard, D. M. Simultaneous measurement of 25 inflammatory markers and neurotrophins in neonatal dried blood spots by immunoassay with xMAP technology. Clin Chem. 51 (10), 1854-1866 (2005).
- Amadori, D., et al. Vitamin D receptor polymorphisms or serum levels as key drivers of breast cancer development? The question of the vitamin D pathway. Oncotarget. 8 (8), 13142-13156 (2017).
- Gupta, B. P., Jayasuryan, N., Jameel, S. Direct detection of hepatitis B virus from dried blood spots by polymerase chain reaction amplification. J Clin Microbiol. 30 (8), 1913-1916 (1992).
- Colson, K. E., Potter, A., Conde-Glez, C., Hernandez, B., RíosZertuche, D., Zúñiga-Brenes, P. Use of a commercial ELISA for the detection of measles-specific immunoglobulin G (IgG) in dried blood spots collected from children living in low-resource settings. J Med Virol. 87 (9), 1491-1499 (2015).
- Drabe, C. H., Blauenfeldt, T., Ruhwald, M. ELISA-based assay for IP-10 detection from filter paper samples. Methods Mol Biol. 1172, 27-37 (2014).
- St Julien, K. R., et al. High quality genome-wide genotyping from archived dried blood spots without DNA amplification. PLoS One. 8 (5), e64710 (2013).
- Shaner, R. L., Schulze, N. D., Seymour, C., Hamelin, E. I., Thomas, J. D., Johnson, R. C. Quantitation of fentanyl analogs in dried blood spots by flow-through desorption coupled to online solid phase extraction tandem mass spectrometry. Anal Methods. 9, 3876-3883 (2017).
