Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Summary

Här presenterar vi två protokoll för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler. För isolerade mitokondrier, vi detalj en plate reader-baserade Ca^{2 +} import assay med de Ca^{2 +} känsliga färga kalcium grön-5N. För odlade celler beskriver vi en konfokalmikroskopi metod där Ca^{2 +} färgämnet Rhod-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} hantering av mitokondrierna är en kritisk funktion som reglerar både fysiologiska och patofysiologiska processer i ett brett spektrum av celler. Förmågan att noggrant mäta inflödet och utflödet av Ca^{2 +} från mitokondrier är viktigt för att fastställa rollen av mitokondriell Ca^{2 +} hantering i dessa processer. I denna rapport presenterar vi två metoder för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} hantering både isolerade mitokondrier och odlade celler. Vi detalj först en tallrik läsare-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} upptag med de Ca^{2 +} känsliga dye kalcium grön-5N. Det platta läsare-baserade formatet kringgår behovet av specialutrustning och kalcium grön-5N färgämnet är idealiskt lämpad för att mäta Ca^{2 +} från isolerade vävnaden mitokondrier. För vår ansökan beskriver vi mätning av mitokondriell Ca^{2 +} upptag i mitokondrierna som isolerats från mus hjärta vävnad; dock kan detta förfarande tillämpas för att mäta mitokondriell Ca^{2 +} upptag i mitokondrierna isolerade från andra vävnader såsom levern, skelettmuskel och hjärnan. För det andra beskriver vi en confocal microscopy-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} i permeabilized celler använder Ca^{2 +} känsliga färgämnet Rhod-2/AM och imaging använder 2-dimensionell laserskanning mikroskopi. Detta permeabilisering protokoll eliminerar cytosoliska dye kontaminering, möjliggör specifika inspelning av ändringar i mitokondriell Ca^{2 +}. Dessutom tillåter laserskanning mikroskopi för hög bildfrekvens att fånga snabba förändringar i mitokondriell Ca^{2 +} svar på olika droger eller reagenser som används i den externa lösningen. Detta protokoll kan användas för att mäta mitokondriell Ca^{2 +} upptag i många celltyper inklusive primära celler såsom hjärt myocyter och nervceller och förevigade cellinjer.

Introduction

Mitokondrierna är kritiska platser av intracellulära Ca^{2 +} lagring och signalering. Decennier av forskning har visat att mitokondrierna har förmågan att importera och binda Ca^{2 + 1,2}. Mitokondrier är dock inte bara passiva platser Ca^{2 +} lagring. Ca^{2 +} på mitokondriell facket utför grundläggande signalering funktioner inklusive reglering av metabola utdata och aktivering av mitokondrie-medierad cell death gångvägar, som har granskat tidigare³. För metabolisk reglering ökar Ca^{2 +} aktiviteten hos tre matrix-lokaliserad mellan östradiol och östron av den tricarboxylic syra cykel samt respiratoriska kedja komplex, att öka mitokondriell energi produktion^4,5 . Med mitokondriell Ca^{2 +} överbelastning och dysreglerad mitokondriell Ca^{2 +} hantering, Ca^{2 +} utlösare mitokondriell permeabilitet övergången pore (MPTP) öppning, leder till mitokondriell inre membranet vilket, membranet potentiella förlust, mitokondriell dysfunktion, svullnad, brista och i slutändan cell död^6,7,8,9. Således, mitokondriell Ca^{2 +} signalering direkt påverkar både cellulära liv och död vägar genom metabol kontroll och MPTP-döden axel.

Under de senaste åren, det har snabbt växande intresse i studien av mitokondriell Ca^{2 +} dynamics förfaller i stor del till att identifiera de molekylära beståndsdelarna av den mitokondriella Ca^{2 +} uniporter complex, en mitokondriell inre membranet transportör som är en primär läge Ca^{2 +} importera till mitokondriella matris ^10,11,12. Identifiering av dessa strukturella och reglerande subenheter av uniporter har frambringat möjligheten att genetiskt inriktning mitokondriell Ca^{2 +} inflödet för att modulera mitokondriell funktion och dysfunktion och underlättade studiet av de bidrag av uniporter komplexa och mitokondrie Ca^{2 +} tillströmningen till sjukdom^13,14,15. Faktiskt, mitokondriell Ca^{2 +} signalering har varit inblandad i patologier av en mångfald av sjukdomar allt från hjärtsjukdom till neurodegeneration och cancer^{16,17,18, 19,20}.

Med tanke på den grundläggande betydelsen av mitokondriell Ca^{2 +} signalering i metabolism och celldöd, och kombinerat med den breda räckhåll för biologiska system påverkar att mitokondriell Ca^{2 +} signalering, metoder att bedöma mitokondriell Ca^{2 +} tillströmningen är av stort intresse. Inte överraskande, en mängd tekniker och verktyg att mäta mitokondriell Ca^{2 +} har utvecklats. Dessa inkluderar metoder som använder verktyg som fluorescerande Ca^{2 +}-känsliga färgämnen^21,22 och genetiskt-kodade Ca^{2 +} sensorer riktade till mitokondrierna, såsom cameleon och aequorin^{23, 24}. Målet med denna artikel är att belysa olika metoder och modellsystem där mitokondrie Ca^{2 +} upptag kan mätas. Vi presenterar två experimentella metoder för att utvärdera mitokondriella Ca^{2 +} tillströmning kapacitet. Med hjärt mitokondrier som exempel, vi detalj en plate reader-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} upptag med de Ca^{2 +} känsliga färga kalcium grön-5N som är idealisk för isolerade vävnaden mitokondrier¹⁴ . Med hjälp av odlade NIH 3T3-celler, beskriver vi också en konfokalmikroskopi imaging-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca^{2 +} i permeabilized celler med Ca^{2 +} känsliga färgämnet Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Alla metoder som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Emory University. Obs: Den första delen är experimentella förfarandet för mätning mitokondriell Ca2 + tillströmning i isolerade hjärt mitokondrier med hjälp av en tallrik-läsare. 1. reagenser och lösningar Gör 500 mL MS-EGTA buffert för mitokondriell isolering: 225 mM mannitol, 75 mM sackaros, 5 mM 4-(2-hydroxyet…

Representative Results

Figur 1 visar mitokondriell Ca2 + upptag mätningar i isolerade hjärt mitokondrier med hjälp av plattan läsare-baserade plattformen och den Ca2 + färga kalcium grön-5N. Under kontrollförhållanden (figur 1A), hjärt mitokondrier var upphängd i KCl buffert innehållande kalcium grön-5N och sedan utmanade med sekventiell pulser CaCl2 (5 μL av en 0,6 mM CaCl2 lösning) lagt till v…

Discussion

Här beskriver vi två olika metoder för att mäta mitokondriell Ca^{2 +} tillströmning. Den plattan läsare-baserade kalcium grön-5N metod bildskärmar extramitochondrial Ca^{2 +} nivåer och är en Ca^{2 +} upptag som lämpar sig väl för mätningar i isolerade mitokondrier. Medan vi har visat representativa resultat från isolerade murina hjärt mitokondrier, kan denna analys lätt anpassas för mitokondrierna isolerade från vävnader med hög mitokondriell överflöd inklusive lever, skel…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440