ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

Summary

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca^{2 +}流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca^{2 +}インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca^{2 +}敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca^{2 +}染料ロード-2/AM を用いた共焦点顕微鏡法について述べる。

Abstract

Ca^{2 +}ミトコンドリアによって処理細胞の広範なスペクトルでの生理学的および病態生理学的プロセスを調節する重要な機能です。Ca^{2 +}ミトコンドリアからの流出や流入を正確に計測する能力は、ミトコンドリア Ca^{2 +}これらのプロセスでの処理の役割を決定するため重要です。本報告では、ミトコンドリアの Ca^{2 +}ハンドリング分離ミトコンドリアや培養細胞での測定のための 2 つの方法を提案する.我々 はまず、Ca^{2 +}敏感な染料カルシウム グリーン-5N を使用してミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを詳しく説明します。プレート リーダー ベースの形式は、特殊な装置の必要性を回避し、カルシウム グリーン 5N 色素は Ca^{2 +}分離組織のミトコンドリアからの測定に最適です。アプリケーションでは、マウス心臓組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収の測定について説明します。ただし、肝臓、骨格筋、脳など他の組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定するこの手順を適用することができます。第二に、共焦点顕微鏡を用いたミトコンドリア Ca^{2 +} Ca^{2 +}敏感な染料ロード-午前/2 を使用して、2 次元レーザー走査型顕微鏡を用いたイメージング グリセリン細胞の測定の測定について述べる。この透過プロトコルは、ミトコンドリア Ca^{2 +}での変更の特定の録音を可能にする細胞内色素汚染を排除します。また、レーザ走査型顕微鏡高フレーム レートのミトコンドリア Ca^{2 +}に様々 な薬や試薬の外部のソリューションの適用応答で急激な変化をキャプチャすることができます。このプロトコルは、初代培養細胞不死化細胞株や神経細胞、心筋細胞などを含む多くの細胞タイプのミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定に適用できます。

Introduction

ミトコンドリアは、細胞内 Ca^{2 +}貯蔵とシグナル伝達の重要なサイトです。数十年の研究は、ミトコンドリアがインポートし、Ca^{2 + 1,2}を隔離する能力を持っていることを示しています。しかし、ミトコンドリアは Ca^{2 +}貯蔵の単なる受動的なサイトではありません。Ca^{2 +}ミトコンドリアのコンパートメントで代謝の出力の調節などの基本的なシグナリング機能を実行し、ミトコンドリアを介した細胞死経路の活性化されている見直し以前³。代謝調節の Ca^{2 +}活性を高めるトリカルボン酸だけでなく、呼吸鎖複合体、ミトコンドリアのエネルギー生産^{4,5 を増加する 3 マトリックス ローカライズ脱水素酵素の}.ミトコンドリアの Ca^{2 +}過負荷と調節不全ミトコンドリアの Ca^{2 +}ハンドリング、Ca^{2 +}トリガー ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (MPTP) 入り口、ミトコンドリア内膜の透過膜の潜在的な損失、ミトコンドリア機能障害、腫脹、破裂し、最終的には、細胞死^6,7,8,9。細胞生命と死の経路を通じて代謝制御と MPTP 死の軸がこのように、ミトコンドリアの Ca^{2 +}シグナリング直接影響します。

近年が急速に普及したためミトコンドリア Ca^{2 +}動態の研究に関心のミトコンドリアの Ca^{2 +}細胞複雑な分子成分の同定に大きい部分、ミトコンドリア内Ca^{2 +}の主なモードは、膜輸送体は、ミトコンドリアのマトリックス^10、11,12にインポートします。細胞の構造および調節サブユニットの同定はミトコンドリアの機能と機能障害を調節するためのミトコンドリアの Ca^{2 +}流入をターゲット遺伝子の可能性をもたらしたし、の研究を促進、細胞複合体とミトコンドリア Ca^{2 +}流入病^13,14,15への貢献。確かに、様々 な神経変性疾患、および癌^{16,17,18、心臓病に至る疾患の病態に関与しているミトコンドリアの Ca2 +シグナル伝達 19,20}。

ミトコンドリア Ca^{2 +}代謝と細胞死のシグナル伝達の基本的な重要性を与えられ、生物学的システムの広い範囲と組み合わせるそのミトコンドリア Ca^{2 +}シグナル伝達への影響、ミトコンドリアの Ca 2 +^{を評価する手法}流入が大きな関心を集めています。当然ながら、さまざまな技術やミトコンドリア Ca^{2 +}を測定するためのツールが開発されています。蛍光 Ca^{2 +}などのツールを利用する方法が含まれます-敏感な染料^21,22と^{遺伝子にコードされた Ca 2 +}センサー cameleon、イクオリン^{23など、ミトコンドリアを対象と 24}。この記事の目的は、さまざまな方法やミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定できるモデル システムを強調することです。ミトコンドリアの Ca^{2 +}流入能力を評価する 2 つの実験的手法を提示します。例として心臓のミトコンドリアを使用、プレート リーダー ベースのプラットフォームの詳細に説明してミトコンドリア Ca^{2 +}の測定を使用して、Ca^{2 +}敏感な吸収色素分離組織のミトコンドリア^{14 に最適ですカルシウム グリーン 5N}.共焦点顕微鏡イメージングを用いたのミトコンドリア Ca^{2 +} Ca^{2 +}敏感な染料ロード-2/午前²⁵を用いたグリセリンの細胞の測定の測定について述べるも NIH 3T3 細胞を使用して、.

Protocol

このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは、制度的動物のケアと使用エモリー大学委員会によって承認されています。 注: 最初の部分は、プレート リーダーを使用して分離心筋ミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +流入を測定する実験です。 1. 試薬および解決 500 mL のミトコンドリアの分離のための MS グリコールエーテ?…

Representative Results

図 1ミトコンドリア Ca2 +取り込み測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを使用して分離心筋ミトコンドリアで、Ca2 +カルシウム グリーン-5N を染めます。制御条件 (図 1 a) 心筋ミトコンドリアいたカルシウム グリーン-5N を含む KCl バッファー中に浮遊し、30 の追加 CaCl2 (0.6 mM CaCl2?…

Discussion

ここでは、ミトコンドリアの Ca^{2 +}流入を測定する 2 つの異なるアプローチについて述べる。プレート リーダー ベース カルシウム グリーン 5N 法モニター extramitochondrial Ca^{2 +}レベルであり、Ca^{2 +}取り込みアッセイは、分離ミトコンドリアでの測定に適しています。我々 は分離されたマウス心筋ミトコンドリアから代表的な結果を示している、このアッセイことが高いミ?…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440