Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Summary

Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca^{2 +} импорта с помощью Ca^{2 +} чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca^{2 +} краситель кондицио-2/AM.

Abstract

CA^{2 +} обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca^{2 +} от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca^{2 +} обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca^{2 +} обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с использованием Ca^{2 +} чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca^{2 +} от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клеток с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca^{2 +}. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca^{2 +} в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.

Introduction

Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca^{2 +} хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca^{2 + 1,2}. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca^{2 +} хранения. CA^{2 +} в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее³. Для регуляции метаболизма Ca^{2 +} усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства^4,5 . С митохондриальных Ca^{2 +} перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca^{2 +} обработка Ca^{2 +} триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти^6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.

В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca^{2 +} в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca^{2 +} Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca^{2 +} импорт в митохондриальной матрицы ^10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca^{2 +} приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca^{2 +} притока к болезни^13,14,15. Действительно митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на^{16,,1718, 19,20}.

Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca^{2 +} сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca^{2 +} . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca^{2 +}-чувствительных красители^21,22 и генетически закодированный Ca^{2 +} датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин^{23, 24}. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca^{2 +} поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с помощью Ca^{2 +} чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий¹⁴ . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клетки, с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM²⁵.

Protocol

Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены институциональный уход животных и использование комитета университета Эмори. Примечание: Первая часть является экспериментальная процедура измерения митохондриальной Ca2 + приток в изолированных сердечно?…

Representative Results

Рисунок 1 показывает митохондриальной Ca2 + измерения поглощения в изолированные сердца митохондрий, используя платформу на основе чтения пластины и Ca2 + краситель кальция Грин 5N. В условиях управления (рис. 1а), сердечной митох…

Discussion

Здесь мы опишем два различных подхода для измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток. Плиты на основе чтения кальция Грин 5N метод мониторов extramitochondrial Ca^{2 +} уровнях и Ca^{2 +} поглощение assay который хорошо подходит для измерений в изолированных митохондриях. В то время как мы показ?…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440