Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca^{2 +} Import Assay mit Ca^{2 +} sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca^{2 +} Farbstoffs Rhod-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} Handhabung durch Mitochondrien ist eine kritische Funktion reguliert physiologische und pathophysiologische Prozesse in einem breiten Spektrum von Zellen. Die Fähigkeit, genau den Zustrom und Ausfluss von Ca^{2 +} von Mitochondrien zu messen ist wichtig für die Bestimmung der Rolle der mitochondrialen Ca^{2 +} Umgang in diesen Prozessen. In diesem Bericht stellen wir Ihnen zwei Methoden zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Handhabung in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Wir beschreiben zunächst eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme über die Ca^{2 +} sensibler Farbstoff Kalzium grün-5N. Leser-basierte Plattenformat umgeht die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung und Kalzium grün-5N Farbstoff ist ideal geeignet zur Messung von Ca^{2 +} aus isolierten Gewebe Mitochondrien. Für unsere Anwendung beschreiben wir die Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien von Herzgewebe Maus isoliert; Allerdings kann dieses Verfahren angewendet werden, zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien isoliert von anderen Geweben wie z. B. Leber, Skelettmuskel und Gehirn. Zweitens, beschreiben wir eine konfokale Mikroskopie-basierten Test zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} in permeabilized Zellen mithilfe des Ca^{2 +} sensibleren Farbstoffs Rhod-2/AM und imaging mit 2-dimensionale Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll Permeabilisierung beseitigt cytosolischen Farbstoff Kontamination, spezifische Aufzeichnung der Veränderungen der mitochondrialen Ca^{2 +}ermöglicht. Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht darüber hinaus hohe Bildraten erfassen schnelle Veränderungen mitochondrialen Ca^{2 +} als Reaktion auf verschiedene Medikamente oder Reagenzien in die externe Lösung angewendet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in vielen Zelltypen, einschließlich Primärzellen wie kardialen Myozyten Neuronen und immortalisierte Zelllinien zu messen.

Introduction

Mitochondrien sind kritische Websites der intrazellulären Ca^{2 +} -Lager- und Signaltechnik. Jahrzehntelange Forschungen haben gezeigt, dass Mitochondrien die Fähigkeit haben zu importieren und sequester Ca^{2 + 1,2}. Mitochondrien, sind jedoch nicht nur passive Websites von Ca^{2 +} -Lager. Ca^{2 +} auf die mitochondriale Kompartiment führt grundlegende Signalisierung Funktionen einschließlich der Regulierung metabolische Ausgabe und Aktivierung von mitochondrialen vermittelte Zelle Tod wegen, wurde zuvor³überprüft. Für die Stoffwechselregulation erhöht Ca^{2 +} die Aktivität von drei Matrix-lokalisierte Dehydrogenases Tricarboxylic Säure Zyklus sowie die Atmungskette komplexe, Erhöhung der Mitochondrien Energie Produktion^4,5 . Mit mitochondrialen Ca^{2 +} Überlastung und Dysregulated mitochondriale Ca^{2 +} Handling Ca^{2 +} Trigger mitochondrialen Permeabilität Übergang pore (MPTP) Öffnung, was zu inneren mitochondrialen Membran Permeabilisierung, Membran Verlustrisiko, mitochondriale Dysfunktion, Schwellungen, Bruch und letztlich Zelle Tod^6,7,8,9. Daher wirkt sich mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung direkt zelluläre Leben und Tod Wege durch metabolische Kontrolle und MPTP-Tod-Achse.

In den letzten Jahren, es wurde rasch erweitert Interesse an der Erforschung der mitochondrialen Ca^{2 +} Dynamik im großen Teil zur Identifizierung der molekularen Bestandteile der mitochondrialen Ca^{2 +} Uniporter Komplex, eine mitochondrial Inner Membran-Transporter, der eine primäre Ca^{2 +} ist in der mitochondrialen Matrix ^10,11,12importieren. Identifizierung von diesen strukturellen und regulatorischen Untereinheiten der Uniporter hat die Möglichkeit, gezielt genetisch mitochondriale Ca^{2 +} Zustrom zu modulieren, mitochondriale Funktion und Dysfunktion hervorgebracht und erleichtert das Studium der der Beitrag der Uniporter komplex und mitochondriale Ca^{2 +} Zustrom Krankheit^13,14,15. In der Tat hat die mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung in den Pathologien von den unterschiedlichsten Krankheiten wie Herzerkrankungen, Neurodegeneration und Krebs^{16,17,18verwickelt, 19,20}.

Angesichts der grundlegenden Bedeutung der mitochondrialen Ca^{2 +} signalisieren in den Stoffwechsel und Zelltod und kombiniert mit der großen Reichweite von biologischen Systemen auswirkt, mitochondriale Ca^{2 +} Signalisierung, Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom von großem Interesse sind. Nicht überraschend, wurden eine Vielzahl von Techniken und Instrumenten zur mitochondrialen Ca^{2 +} Messung entwickelt. Dazu gehören Methoden, die nutzen Sie Tools wie z. B. fluoreszierende Ca^{2 +}-empfindlichen Farbstoffen^21,22 und genetisch codierte Ca^{2 +} Sensoren gezielt zu den Mitochondrien, wie z. B. Cameleon und Aequorin^{23, 24}. Das Ziel dieses Artikels ist, markieren Sie verschiedene Methoden und Modellsysteme in denen mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme gemessen werden kann. Wir präsentieren zwei experimentelle Methoden zur Beurteilung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom Kapazität. Mit kardialen Mitochondrien als Beispiel, wir ausführlich eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme mit Ca^{2 +} sensible färben Kalzium grün-5N, die ideal geeignet ist für isolierte Gewebe Mitochondrien¹⁴ . Mit kultivierten Zellen der NIH-3 t 3, erläutern wir im folgenden eine konfokalen Mikroskopie Imaging-basierte Test zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} in permeabilized Zellen mit der Ca^{2 +} sensibler Farbstoff Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Emory University genehmigt. Hinweis: Der erste Teil ist die Versuchsdurchführung zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten kardialen Mitochondrien mit einem Teller-Reader. (1) Reagenzien und Lösungen 500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung zu machen: 225 mM Mannit, 75 mM Saccharose, 4 5 mM-(2-h…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt mitochondriale Ca2 + Aufnahme Messungen in isolierten kardialen Mitochondrien mit der Platte Leser-basierte Plattform und die Ca2 + Kalzium grün-5N färben. Unter Kontrolle Bedingungen (Abbildung 1A), kardialen Mitochondrien in KCl-Puffer, enthält Kalzium grün-5N ausgesetzt waren und dann vor der Herausforderung, sequentielle Impulse von CaCl2 (5 μl einer 0,6 mm CaCl2</s…

Discussion

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom. Die Platte Leser-basierte Kalzium grün-5N Methode Monitore Extramitochondrial Ca^{2 +} Ebenen und ist ein Ca^{2 +} Aufnahme Assay, der gut geeignet für Messungen in isolierten Mitochondrien ist. Während wir repräsentative Ergebnisse aus isolierten murinen kardialen Mitochondrien gezeigt haben, kann dieser Assay Mitochondrien isoliert von Geweben mit hoher mitochondriale Fülle einschließlich Lebe…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440