Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca^{2 +} Import Assay mit Ca^{2 +} sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca^{2 +} Farbstoffs Rhod-2/AM.

Zusammenfassung

Ca^{2 +} Handhabung durch Mitochondrien ist eine kritische Funktion reguliert physiologische und pathophysiologische Prozesse in einem breiten Spektrum von Zellen. Die Fähigkeit, genau den Zustrom und Ausfluss von Ca^{2 +} von Mitochondrien zu messen ist wichtig für die Bestimmung der Rolle der mitochondrialen Ca^{2 +} Umgang in diesen Prozessen. In diesem Bericht stellen wir Ihnen zwei Methoden zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Handhabung in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Wir beschreiben zunächst eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme über die Ca^{2 +} sensibler Farbstoff Kalzium grün-5N. Leser-basierte Plattenformat umgeht die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung und Kalzium grün-5N Farbstoff ist ideal geeignet zur Messung von Ca^{2 +} aus isolierten Gewebe Mitochondrien. Für unsere Anwendung beschreiben wir die Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien von Herzgewebe Maus isoliert; Allerdings kann dieses Verfahren angewendet werden, zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in den Mitochondrien isoliert von anderen Geweben wie z. B. Leber, Skelettmuskel und Gehirn. Zweitens, beschreiben wir eine konfokale Mikroskopie-basierten Test zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} in permeabilized Zellen mithilfe des Ca^{2 +} sensibleren Farbstoffs Rhod-2/AM und imaging mit 2-dimensionale Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll Permeabilisierung beseitigt cytosolischen Farbstoff Kontamination, spezifische Aufzeichnung der Veränderungen der mitochondrialen Ca^{2 +}ermöglicht. Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht darüber hinaus hohe Bildraten erfassen schnelle Veränderungen mitochondrialen Ca^{2 +} als Reaktion auf verschiedene Medikamente oder Reagenzien in die externe Lösung angewendet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um mitochondrialen Ca^{2 +} Aufnahme in vielen Zelltypen, einschließlich Primärzellen wie kardialen Myozyten Neuronen und immortalisierte Zelllinien zu messen.

Einleitung

Mitochondrien sind kritische Websites der intrazellulären Ca^{2 +} -Lager- und Signaltechnik. Jahrzehntelange Forschungen haben gezeigt, dass Mitochondrien die Fähigkeit haben zu importieren und sequester Ca^{2 + 1,2}. Mitochondrien, sind jedoch nicht nur passive Websites von Ca^{2 +} -Lager. Ca^{2 +} auf die mitochondriale Kompartiment führt grundlegende Signalisierung Funktionen einschließlich der Regulierung metabolische Ausgabe und Aktivierung von mitochondrialen vermittelte Zelle Tod wegen, wurde zuvor³überprüft. Für die Stoffwechselregulation erhöh....

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Emory University genehmigt.

Hinweis: Der erste Teil ist die Versuchsdurchführung zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom in isolierten kardialen Mitochondrien mit einem Teller-Reader.

(1) Reagenzien und Lösungen

1. 500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung zu machen: 225 mM Mannit, 75 mM Saccharose, 4 5 mM-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA), pH auf 7,4 einge....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt mitochondriale Ca^{2 +} Aufnahme Messungen in isolierten kardialen Mitochondrien mit der Platte Leser-basierte Plattform und die Ca^{2 +} Kalzium grün-5N färben. Unter Kontrolle Bedingungen (Abbildung 1A), kardialen Mitochondrien in KCl-Puffer, enthält Kalzium grün-5N ausgesetzt waren und dann vor der Herausforderung, sequentielle Impulse von CaCl₂ (5 μl einer 0,6 mm CaCl₂ -.......

Diskussion

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Messung der mitochondrialen Ca^{2 +} Zustrom. Die Platte Leser-basierte Kalzium grün-5N Methode Monitore Extramitochondrial Ca^{2 +} Ebenen und ist ein Ca^{2 +} Aufnahme Assay, der gut geeignet für Messungen in isolierten Mitochondrien ist. Während wir repräsentative Ergebnisse aus isolierten murinen kardialen Mitochondrien gezeigt haben, kann dieser Assay Mitochondrien isoliert von Geweben mit hoher mitochondriale Fülle einschließlich Leber, Skel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Olympus FV1000 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode-Mikroplatten-Reader mit Injektoren	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm Deckgläser	Corning	2850-22
96-Well-Platte	Corning	3628
6 Well-Platte	Corning	3506
Calcium grün-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker grün FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Saccharose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Kaliumchlorid	Fisher	BP366-500
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma	P0662
Magnesiumchlorid	Sigma	M2670
Natriumpyruvat	Sigma	P2256
L-Apfelsäure	Sigma	M1125
Calciumchlorid	Sigma	C4901
Kaliumacetat	Fisher	BP364-500
Adenosin 5′-triphosphat Magnesiumsalz	Sigma	A9187
Phosphokreatin Dinatriumsalz	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440