ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Summary

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca^{2 +} זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca^{2 +} ייבוא assay באמצעות של Ca^{2 +} רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca^{2 +} לצבוע רוד-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} טיפול על ידי המיטוכונדריה היא פונקציה קריטית ויסות תהליכים פיזיולוגיים והן pathophysiological, בקשת רחבה של תאים. היכולת למדוד במדויק את זרם ואת בזרימת של Ca^{2 +} של המיטוכונדריה חשובה לקביעת בתפקיד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} טיפול בתהליכים אלה. בדו ח זה, אנו מציגים שתי שיטות המדידה של Ca^{2 +} טיפול מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד והן תאים בתרבית. אנחנו קודם פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת באמצעות של Ca^{2 +} צבע רגיש סידן הירוק-5N. הפורמט מבוסס על הקורא צלחת עוקף את הצורך ציוד מיוחד, הצבע הירוק-5N סידן מתאימה באופן אידיאלי למדידת Ca^{2 +} של המיטוכונדריה רקמה מבודדת. עבור היישום שלנו, אנו מתארים את המדידה של Ca^{2 +} ספיגת מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מן העכבר רקמת הלב; עם זאת, ניתן להחיל הליך זה למדוד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת בתוך המיטוכונדריה מבודד לרקמות אחרות כגון הכבד, שרירי השלד, המוח. שנית, אנו מתארים assay מבוסס-מיקרוסקופ קונפוקלי למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} תאים permeabilized באמצעות Ca^{2 +} רגיש לצבוע רוד-2/AM והדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקה בלייזר 2-ממדי. פרוטוקול permeabilization זה מבטל זיהום צבע cytosolic, המאפשר הקלטה ספציפית של שינויים ב Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}. יתר על כן, מיקרוסקופיה סריקה בלייזר מאפשר קצב גבוה ללכוד את השינויים המהירים מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתגובה סמים או ריאגנטים ליישם את הפתרון חיצוניים שונים. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי למדוד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת סוגי תאים רבים, כולל ראשי תאים כגון של תאי שריר הלב ונוירונים, שורות תאים מונצח.

Introduction

המיטוכונדריה הם אתרים קריטיות של Ca תאיים^{2 +} אחסון איתות. עשורים של מחקרים הוכיחו כי המיטוכונדריה יש את היכולת לייבא sequester Ca^{2 + 1,2}. המיטוכונדריה, לעומת זאת, הם לא רק פסיבי אתרים של Ca^{2 +} אחסון. Ca^{2 +} -תא מיטוכונדריאלי מבצע היסוד פונקציות איתות לרבות ויסות חילוף החומרים פלט, הפעלה של מסלולים מוות תא מיטוכונדריאלי בתיווך, אשר כבר נבדקו בעבר³. עבור רגולציה חילוף החומרים, Ca^{2 +} מגביר את הפעילות של שלוש dehydrogenases מטריקס מותאם לשפות אחרות של מחזור חומצה tricarboxylic, כמו גם קומפלקסי שרשרת הנשימה, כדי להגדיל את האנרגיה מיטוכונדריאלי ייצור^4,5 . Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} עומס, dysregulated מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} טיפול, Ca^{2 +} גורמים מפעילים חדירות מיטוכונדריאלי המעבר הנקבוביות הפתיחה (MPTP), המוביל אל permeabilization מיטוכונדריאלי הממברנה הפנימית, אובדן פוטנציאל ממברנה, תפקוד מיטוכונדריאלי, נפיחות, קרע וסלולרי בסופו של דבר, למוות^6,7,8,9. לפיכך, Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי משפיעה במישרין על החיים הסלולר והן מוות שבילים דרך בקרה מטבולית וציר MPTP-מוות.

בשנים האחרונות, שם במהירות הרחבה עניין במחקר של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} דינמיקה עקב חלק גדול לזיהוי של המרכיבים מולקולרית מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} uniporter מורכבים, של הפנימית מיטוכונדריאלי טרנספורטר קרום זה מצב ראשי של Ca^{2 +} לייבא לתוך מטריצה מיטוכונדריאלי ^10,11,12. זיהוי של אלה subunits מבנית ותקינה של uniporter לדרדר את האפשרות של פילוח גנטי מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} זרם לווסת מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי, יעברו חקר התרומה של uniporter מיטוכונדריאלי ומורכבת Ca^{2 +} זרם המחלה^13,14,15. אכן, Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי היה מעורב של פתולוגיות של מערך מגוון של מחלות ועד מחלות לב הקשורים ניוון מוחיים, וסרטן^{16,17,18, 19,20}.

את החשיבות הבסיסית של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} איתות של חילוף החומרים, מוות של תאים, בשילוב רחב של מערכות ביולוגיות הזה Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי משפיע, שיטות להערכת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} זרם הם עניין רב. באופן לא מפתיע, פותחו מגוון רחב של טכניקות וכלים למדידת Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} . אלה כוללים שיטות לנצל כלים כגון Ca פלורסנט^{2 +}-צבעי רגיש^21,22 ו מקודד גנטית Ca^{2 +} חיישנים ממוקד המיטוכונדריה, כגון cameleon ו aequorin^{23, 24}. המטרה של מאמר זה היא כדי להדגיש שיטות שונות ומערכות מודל שבו ניתן למדוד Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ספיגת. אנו מציגים שתי שיטות נסיוניות להעריך Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} זרם קיבולת. באמצעות הלב המיטוכונדריה כדוגמה, אנחנו פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ספיגת באמצעות של Ca^{2 +} רגיש לצבוע סידן ירוק-5N זה מתאים באופן אידיאלי עבור רקמה מבודדת המיטוכונדריה¹⁴ . שימוש בתרבית תאים 3T3 NIH, נתאר גם וזמינותו של דימות מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתאים permeabilized באמצעות Ca^{2 +} רגיש לצבוע רוד-2/AM²⁵.

Protocol

כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת אמורי. הערה: החלק הראשון הוא ההליך ניסיוני. למדידת מיטוכונדריאלי Ca2 + זרם בתוך המיטוכונדריה לב מבודד שימוש בקורא צלחת. 1. נוגדנים ופתרונות להפוך 500 מ”ל…

Representative Results

איור 1 מציג Ca מיטוכונדריאלי2 + ספיגת מדידות מבודד המיטוכונדריה הלב באמצעות הפלטפורמה המבוססת על הקורא צלחת, Ca2 + סידן ירוק-5N צבע. בתנאים שליטה (איור 1 א’), המיטוכונדריה הלב היו מושעה אשלגן כלורי מאגר המכיל סידן ירוק-5N והזמנו ואז עם ?…

Discussion

כאן, אנו מתארים שתי גישות שונות כדי למדוד Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} זרם. הצלחת סידן המבוסס על הקורא ירוק-5N שיטת צגים extramitochondrial Ca^{2 +} רמות, Ca^{2 +} ספיגת assay זה גם מתאים מידות המיטוכונדריה מבודד. בעוד אנחנו הראו תוצאות נציג מבודד מאתר המיטוכונדריה הלב, וזמינותו הזה יכול להיות מותאם בקלות ?…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440