Micromanipulação de cromossomos em espermatócitos insetos
Summary
Neste protocolo, descrevemos a seleção e a preparação de células adequadas para micromanipulação e o uso de um micromanipulador piezoelétrico para reposicionar os cromossomos dentro dessas células.
Abstract
A micromanipulação de cromossomos tem sido um método essencial para iluminar o mecanismo para congression do cromossomo, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase e tem sido a chave para entender o que controla os movimentos do cromossomo durante a divisão celular. Um biólogo especializado pode usar um micromanipulador para desanexar cromossomos do eixo, para reposicionar cromossomos dentro da célula e para aplicar forças aos cromossomas usando uma agulha de vidro pequeno com uma ponta muito fina. Enquanto que as perturbações podem ser feitas para cromossomos usando outros métodos, como armadilhas ópticas e outros usos de um laser, até à data, nenhum outro método permite o reposicionamento dos componentes celulares na escala de dezenas a centenas de micra, com pouco ou nenhum dano à célula .
A seleção e preparação de células adequadas para a micromanipulação de cromossomos, especificamente, descrevendo a preparação do gafanhoto e grilo culturas primárias de maturação para o uso em imagem latente da viver-pilha e micromanipulação, são descritos aqui. Além disso, mostramos a construção de uma agulha a ser usado para mover-se com uma agulha de vidro acompanhada de cromossomos dentro da célula e o uso de um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick para reposicionar os cromossomos dentro das células de divisão. Um resultado de exemplo mostra o uso de um micromanipulador para desanexar um cromossomo de um eixo em uma maturação primário e reposicionar esse cromossomo dentro da célula.
Introduction
Micromanipulação revelou partes do mecanismo de um cromossoma congression, o ponto de verificação do eixo e movimentos de cromossomo anáfase. A mais antiga publicação descrevendo os resultados de experimentos de micromanipulação foi por Robert Chambers1. Câmaras usado um micromanipulador mecânica com uma agulha de vidro anexado para sondar o citoplasma de um número de diferentes tipos de células. Infelizmente, os métodos de contraste que permitiu a visualização dos cromossomos e muitos outros componentes celulares em células vivas não estavam disponíveis na época, para que experimentos de Chambers não podem mostrar os efeitos de reposicionamento tais componentes celulares. Micromanipulations precoce que alterou a posição do cromossomo usado o aparelho de câmaras para varrer a midzone do eixo nas células anáfase, mostrando que tais manipulações podem alterar a posição dos braços do cromossoma em neuroblastos de gafanhoto anáfase2 . Nicklas e seus colaboradores foram os primeiros a realizar bem micromanipulations de cromossomos, esticando os cromossomos3, desanexando-os do eixo e induzir a uma reorientação3,4, estabilizando uma malorientation, aplicando a tensão ao cromossomos5,6,7e medindo as forças produzidas por eixos em anáfase8,9. Outros trabalhos por Nicklas laboratório mostraram que os grânulos citoplasmáticos também podem ser manipulado10 e que podem ser reposicionadas centrossomas micromanipulação11. Micromanipulação não é apenas útil para mover cromossomos e outros componentes celulares. Uma agulha de micromanipulação limpa pode cortar um fuso mitótico em células de demembranated12 , ou pode ser usada para dissolver o envelope nuclear13. Além disso, células adjacentes podem ser fundidas por micromanipulação14,15.
Com uma grande variedade de experiências interessantes que pode ser feito usando micromanipulação, é à primeira vista surpreendente que experimentos de micromanipulação tem sido feitos por muito poucos biólogos de cromossomo. Uma razão para esta deficiência é que mitotically-divisão de culturas de células que são derivadas de tecidos de vertebrados e são comumente usadas para estudar os movimentos do cromossomo são extremamente difíceis de micromanipulate. Estas células de cultura de tecido geralmente têm um citoesqueleto cortical que “fica no caminho”, da micromanipulação de agulha e cromossomos também não podem ser alcançados pela agulha ou a agulha mói através da célula, levando a uma ruptura da célula e a morte. Nós e outros experimentadores que usam micromanipulação, encontraram células artrópodes para ser passível de micromanipulação. Artrópodes espermatócitos espalham-se facilmente sob uma camada de óleo halocarbono e parecem ter um muito menos robusto citoesqueleto cortical subjacente da membrana celular durante a divisão celular. Assim, os testículos de artrópodes fornecem uma boa fonte de meiotically-divisão de células (espermatócitos) e mitotically-divisão de células (espermatogónias) com cromossomos facilmente acessíveis para micromanipulação. Um seccionamento serial de uma maturação de gafanhoto fixada durante uma manipulação revelou que a agulha não penetra a membrana celular; a membrana celular deforma ao redor da agulha (Nicklas R.B., comunicação pessoal). Espermatócitos de vários táxons de insetos e aranhas têm sido micromanipulated com sucesso, incluindo gafanhotos, mantids orando, moscas de fruta, guindaste moscas, grilos, spittlebugs, traças, aranhas viúva-negra, aranhas adega e aranhas orb-tecendo 3,7,17,18,19,20,21,22. Cultas, mitotically-divisão de células de insetos podem ser micromanipulated. Por exemplo, os cromossomos em neuroblastos de gafanhoto numa cultura primária têm cromossomos que podem ser prontamente micromanipulated2,23. Suspeitamos que o disponível cultivadas linhas derivadas de Drosophila e outros insetos também será micromanipulatable, embora nós não testamos a técnica com essas células. Vamos mostrar como dividir células de gafanhotos e grilos pode estar preparado para uma micromanipulação. Grilos são fáceis de obter da maioria das lojas de animais em qualquer época do ano. Gafanhotos só são facilmente obteníveis no verão, a menos que o pesquisador tem acesso a uma colônia de laboratório, mas a espécie utilizada (Melanoplus sanguinipes) tem aplainado facilmente células e cromossomos longos, fácil de manipular.
Outra razão por que os experimentos de micromanipulação tem sido feitos por um pequeno punhado de biólogos é que Micromanipuladores que movem os cromossomos bem estão raramente disponíveis no mercado. Descobrimos que um micromanipulador piezoelétrico controlado por joystick controla o movimento da agulha sem vibração, deriva, ou desfasamento entre o movimento do joystick e o movimento da agulha, mas outros tipos de manipuladores também com êxito podem empurrar cromossomos ao redor na célula. Os Micromanipuladores desenhados por Ellis e Begg25,26 são ideais para a micromanipulação de cromossomos, embora eles usam a tecnologia mais antiga. Micromanipuladores piezoelétricos são atualmente disponíveis e comumente utilizada em eletrofisiologia; no entanto, estes Micromanipuladores não são normalmente controlado por joystick. Controle de joystick é chave para os movimentos suaves necessários para uma bem sucedida micromanipulação, e então um joystick personalizado deve ser construído a funcione os Micromanipuladores piezoelétricos atualmente disponíveis para micromanipulação um cromossomo. Os manche-controlou piezoelétricos Micromanipuladores que funcionam melhor tem controle direto da posição, na qual o movimento do joystick traduz diretamente a um movimento de agulha.
Um micromanipulador piezoelétrico recém-projetado pode ser construído de peças comercialmente disponíveis que podem ser facilmente substituídas e de alguns pequenos componentes impressos em 3D, e funciona bem para cromossomo micromanipulação24. O micromanipulador sensibilidade ajustável, posicionamento manual grosseiros e não tem vibração, deriva ou atraso no movimento da agulha e controle direto da posição da agulha. Os cientistas podem construir o micromanipulador usando instruções disponíveis on-line24. Abaixo estão os métodos para a preparação de uma cultura de células primárias de maturação e para micromanipulating os cromossomos dentro das células em cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com a prática, a se mover cromossomos na célula pode se tornar segunda natureza. Agulhas que são suficientemente rígida e suficientemente fina com ponta são difíceis de “pegar o jeito de” fabricando, mas essa capacidade também vem com a prática. Agulhas, que são tão finas que eles deformam quando mudei o óleo halocarbono não será útil para empurrar os cromossomos na célula. Agulhas, que são tão blunt que suas dicas são visíveis e tão grande como 1/3 da largura de um cromossoma (ou maior) é muito prov…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sua valiosa discussão Jessica Hall.
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
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