Микроманипуляции хромосом в насекомое Spermatocytes
Summary
В этом протоколе мы описываем, отбора и подготовки соответствующих клеток для микроманипуляции и использование пьезоэлектрической микроманипулятор для перемещения хромосом в этих ячейках.
Abstract
Микроманипуляции хромосом был важным метод для освещения механизм congression хромосомы, шпиндель контрольно-пропускной пункт и анафазе хромосома движений и был ключом к пониманию, что контролирует движения хромосома во время деления клеток. Опытный биолог можно использовать микроманипулятор для отсоединения хромосомы от шпинделя, чтобы переместить хромосом в клетке и для применения силы к хромосом, с помощью небольшой стеклянный иглу с очень тонкой кончиком. Хотя возмущения могут быть хромосом, используя другие методы, такие как оптические треппинга и других видов использования лазера, до сих пор никакой другой метод позволяет репозиционирования клетчатых компонентов в масштабах от десятков до сотен микрон с практически никаких повреждений в ячейку .
Отбор и подготовка соответствующих клеток для микроманипуляции хромосом, специально описания подготовки первичных культур кузнечик и крикет Сперматоцит для использования в клеток и микроманипуляции, являются описанные здесь. Кроме того мы показываем строительство иглу использоваться для перемещения хромосом внутри клетки и использование джойстика контролируемые пьезоэлектрические микроманипулятор с иглой стекла, прилагается к нему для перемещения хромосом в делящихся клеток. Результат образец показывает использование микроманипулятор для отсоединения хромосомы от шпинделя в первичных Сперматоцит и переместить что хромосом в клетке.
Introduction
Микроманипуляции показал частями механизма для congression хромосомы, шпиндель контрольно-пропускной пункт и анафазе хромосома движений. Ранние публикации, описывающие результаты экспериментов микроманипуляции был Роберт палат1. Камеры используются механические микроманипулятор с прилагаемый стеклянный иглу зонда в цитоплазму целого ряда различных типов клеток. К сожалению контраст методы, которые позволили визуализации хромосом и многих других клеточных компонентов в живых клетках не были доступны в то время, поэтому эксперименты камер не смогли показать последствия перемещения таких клеточных компонентов. Ранние micromanipulations, которые изменили положения хромосомы используется аппарат палат для шпинделя midzone в анафазе клеток, показаны, что такие манипуляции могут изменить положение хромосома оружия в анафазе кузнечик нейробласты2 . Никлас и его сотрудники первыми выполнять тонкой micromanipulations хромосом, растяжения хромосом3, отделение их от шпинделя и вызывая переориентацию3,4, стабилизации malorientation, применяя напряженности в хромосомы5,6,7и измерения силы, производимые шпинделей в анафазе8,9. Другие работы в лаборатории Никлас показал, что цитоплазматических гранул также можно манипулировать10 и что большое может быть приложена микроманипуляции11. Микроманипуляции является не только полезным для перемещения хромосом и других клеточных компонентов. Микроманипуляции иглой можно аккуратно прорезать митотического веретена demembranated клетки12 или может быть использован для растворения ядерная оболочка13. Кроме того смежные ячейки может быть сплавленных микроманипуляции14,15.
С такой широкий спектр интересных экспериментов, которые можно сделать с помощью микроманипуляции, это на первый взгляд удивительно, что микроманипуляции эксперименты сделали очень мало биологов хромосомы. Одна из причин для этого недостатка является чрезвычайно трудно micromanipulate mitotically деления культивировали клетки, которые являются производными от позвоночных тканей и обычно используются для изучения движения хромосомы. Эти клетки культуры ткани, как правило, имеют корковых цитоскелета, что «попадает в пути» из микроманипуляции иглы и хромосомы либо не может быть достигнуто иглы или иглы перемалывает через клетку, ведущей к ячейке и смертью. Мы и других экспериментаторов, которые используют микроманипуляции, нашли членистоногих клетки поддаются микроманипуляции. Членистоногих сперматоцитах легко распространяться под слоем нефти галоидоуглеводородов и представляется гораздо менее надежные корковых цитоскелета, лежащие в основе клеточной мембраны при делении клеток. Таким образом членистоногих яички обеспечивают хороший источник meiotically деления клеток (сперматоцитах) и mitotically деления клетки (сперматогонии) с легко доступными хромосом для микроманипуляции. Серийный секционирование кузнечик Сперматоцит фиксированной во время манипуляции показали, что игла не проникает клеточной мембраны; клеточной мембраны деформирует вокруг иглы (Никлас р.б., личное сообщение). Сперматоцитах от ряда насекомых и пауков таксонов были micromanipulated успешно, включая кузнечики, молиться богомола, плодовых мух, кран мух, сверчков, spittlebugs, моли, пауки Черная вдова, погреб пауков и шар ткачество пауков 3,7,,1718,19,20,21,22. Культурный, mitotically деления клетки от насекомых может быть micromanipulated. К примеру хромосомы в кузнечик нейробласты в первичной культуре имеют хромосом, которые могут быть легко micromanipulated2,23. Мы подозреваем, что имеющиеся культивированный линии, производные от дрозофилы и других насекомых также будет micromanipulatable, хотя мы не проверял технику с этими клетками. Мы покажем, как делящиеся клетки от кузнечиков и сверчков может быть подготовлен для микроманипуляции. Сверчки легко получить из большинство зоомагазинов в любое время года. Кузнечики только легко доступный в летнее время, если исследователь имеет доступ к лаборатории колонии, но видов, используемых (Melanoplus sanguinipes) легко плоские клетки и длинный, легко манипулировать хромосом.
Еще одна причина, почему микроманипуляции эксперименты сделали небольшое биологов, что микроманипуляторы, которые хорошо двигаться хромосом редко доступны на рынке. Мы нашли, что джойстик контролируемые пьезоэлектрические микроманипулятор управляет движением иглу без вибрации, дрейф, или запаздывания между движением джойстика и движение иглы, но другие виды манипуляторов также успешно могут подтолкнуть хромосом вокруг в ячейке. Микроманипуляторы, разработанный Эллис и Бегг25,26 идеальны для микроманипуляции хромосом, хотя они используют старую технологию. Пьезоэлектрические микроманипуляторы, в настоящее время доступны и широко используется в электрофизиологии; Однако эти микроманипуляторов не обычно управляется джойстиком. Джойстик управления является ключом к гладкой движений, необходимых для успешного микроманипуляции, и сконструирована пользовательских джойстик для имеющихся в настоящее время пьезоэлектрические микроманипуляторы работать для микроманипуляции хромосомы. Джойстик контролируемые пьезоэлектрические микроманипуляторы, которые работают лучше всего иметь прямое положение элемента управления, в котором движения джойстика приводит непосредственно к движению иглы.
Недавно разработанных пьезоэлектрический микроманипулятор могут быть построены из коммерчески доступных частей, которые могут быть легко заменены и от некоторых небольших 3-D печатных компонентов, и она работает хорошо для хромосома микроманипуляции24. Микроманипулятор регулируемая чувствительность, ручной грубого определения координат и не имеет вибрации, дрейф или отставание в движение иглы и контроля прямого положения иглы. Ученые могут построить микроманипулятор, с помощью инструкции доступны онлайн24. Ниже приведены методы для подготовки первичной Сперматоцит клеточной культуры и micromanipulating хромосом в клетках в этой культуре.
Protocol
Representative Results
Discussion
С практикой передвижение хромосом в клетке может стать второй натурой. Иглы, которые являются достаточно жесткой и достаточно тонким наконечником трудно «получить умение» фабрикацией, но эта способность также приходит с практикой. Иглы, которые так хорошо, что они деформируются при пе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джессика Hall за ее ценные обсуждения.
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
- Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
- Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
- Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
- Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
- Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
- Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
- Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
- Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
- Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
- Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
- Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
- Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
- Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
- Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
- Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
- Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
- Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
- . . Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , (2018).
- Ellis, G. W. Piezoelectric micromanipulators. Science. 138 (3537), 84-91 (1962).
- Ellis, G. W., Begg, D. A., Zimmerman , . A. M., Forer, A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. , 155-179 (1981).
- Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
- Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
- Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase’ and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).
