Micromanipulation van chromosomen in Insect spermatocyten

Summary

In dit protocol beschrijven we de selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor micromanipulation en het gebruik van een piëzo-elektrische micromanipulator chromosomen verplaatsen binnen die cellen.

Abstract

De micromanipulation van de chromosomen is een essentiële methode voor de verlichting van het mechanisme voor chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen, en is de sleutel tot het begrijpen wat regelt chromosoom bewegingen tijdens een celdeling. Een geschoolde bioloog kunt een micromanipulator loskoppelen van de chromosomen van de spindel, chromosomen verplaatsen binnen de cel, en krachten om op te passen met behulp van een kleine glazen naald met een zeer fijne tip chromosomen. Terwijl verstoringen kunnen worden gemaakt aan chromosomen met behulp van andere methoden zoals optische overlapping en ander gebruik van een laser, tot op heden geen andere methode maakt het mogelijk de herpositionering van cellulaire componenten op de schaal van tientallen tot honderden micron met weinig tot geen schade aan de cel .

De selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor de micromanipulation van de chromosomen, specifiek met een beschrijving van de voorbereiding van de sprinkhaan en cricket spermatocyte primaire culturen voor het gebruik in live-cel beeldvorming en micromanipulation, zijn hier beschreven. Bovendien tonen we de bouw van een naald worden gebruikt voor het verplaatsen van de chromosomen in de cel, en het gebruik van een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator met een glas naald eraan verbonden zijn om te verplaatsen van chromosomen binnen scheidslijn cellen. Een steekproef-resultaat toont het gebruik van een micromanipulator om een chromosoom van een spindel in een primaire spermatocyte los te maken en dat chromosoom verplaatsen binnen de cel.

Introduction

Micromanipulation is gebleken dat delen van het mechanisme voor een chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen. De vroegste publicatie met een beschrijving van de resultaten van de experimenten van de micromanipulation werd door Robert Chambers¹. Chambers gebruikt een mechanische micromanipulator met een bijgevoegde glas naald sonde het cytoplasma van een aantal verschillende soorten cellen. Helaas, contrast methoden waardoor de visualisatie van chromosomen en vele andere cellulaire componenten in levende cellen niet beschikbaar waren op het moment, dus Chambers experimenten niet laten van de gevolgen zien kon van dergelijke cellulaire componenten herpositionering. Vroege micromanipulations die de positie van het chromosoom veranderd gebruikt het apparaat Chambers te vegen van de midzone van de spindel in anafase cellen, waaruit blijkt dat dergelijke manipulaties als u de positie van chromosoom wapens in anafase sprinkhaan neuroblasten^{2 veranderen kunnen} . Nicklas en zijn medewerkers waren de eersten die het uitvoeren van fijne micromanipulations van chromosomen, rekken van de chromosomen³, hen loskoppelen van de spindel en inducerende een heroriëntatie^3,4, stabiliseren van een malorientation door de spanning op de chromosomen^5,6,7toe te passen en het meten van de krachten die geproduceerd door spindels in anafase^8,9. Ander werk door de Nicklas lab toonde dat cytoplasmatische korrels gemanipuleerde¹⁰ ook zou kunnen zijn en dat centrosomes kan worden verplaatst door micromanipulation¹¹. Micromanipulation is niet alleen nuttig voor het verplaatsen van de chromosomen en de andere cellulaire componenten. Een naald micromanipulation netjes kan snijden door middel van een mitotische spindel in demembranated cellen¹² of kan worden gebruikt voor het ontbinden van de nucleaire envelop¹³. Daarnaast kunnen aangrenzende cellen worden gesmolten door micromanipulation^14,15.

Met dergelijke een breed scala aan interessante experimenten die kunnen worden gedaan met behulp van micromanipulation, het is op het eerste gezicht verrassend dat micromanipulation experimenten zijn gedaan door zeer weinig chromosoom biologen. Een van de redenen voor deze tekortkoming is dat de mitotically-delende gekweekte cellen die zijn afgeleid van gewervelde weefsels en worden vaak gebruikt voor het bestuderen van chromosoom bewegingen uiterst moeilijk te micromanipulate. Deze weefselkweek cellen hebben over het algemeen een corticale cytoskelet dat “krijgt in de manier” van de micromanipulation naald, en chromosomen of kunnen niet worden bereikt door de naald of de naald via de cel maalt, wat leidt tot een breuk van de cel en de dood. Wij, en andere onderzoekers die gebruik maken van micromanipulation, hebben gevonden geleedpotigen cellen worden vatbaar voor micromanipulation. Geleedpotigen spermatocyten worden gemakkelijk verspreid onder een laag van halonen olie en lijken te hebben een veel minder robuuste corticale cytoskelet ten grondslag liggen aan de celmembraan tijdens een celdeling. Dus, geleedpotigen teelballen bieden een goede bron van meiotically-delende cellen (spermatocyten) en mitotically-delende cellen (testis) met gemakkelijk toegankelijke chromosomen voor micromanipulation. Een seriële segmenteren van een sprinkhaan-spermatocyte vaste tijdens een manipulatie geopenbaard dat de naald nooit de celmembraan doordringt; de celmembraan vervormt rond de naald (Nicklas R.B., persoonlijke mededeling). Spermatocyten uit een aantal insecten en spinnen taxa geweest micromanipulated met succes, met inbegrip van sprinkhanen, biddende mantids fruitvliegjes, crane vliegen, krekels, spittlebugs, motten, zwarte weduwe spinnen, kelder spinnen en orb-weven spinnen ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Gekweekte, mitotically-delende cellen van insecten kunnen micromanipulated. Bijvoorbeeld, hebben de chromosomen in de sprinkhaan neuroblasten in een primaire cultuur chromosomen die gemakkelijk micromanipulated^{2,23 kunnen}. We vermoeden dat de beschikbare lijnen afgeleid van Drosophila gekweekte en andere insecten ook micromanipulatable zullen, maar we niet de techniek met deze cellen getest hebben. Zullen we laten zien hoe delen van cellen van sprinkhanen en krekels kan worden voorbereid voor een micromanipulation. Krekels zijn eenvoudig te verkrijgen van de meeste dierenwinkels op elk moment van het jaar. Sprinkhanen zijn alleen gemakkelijk verkrijgbaar is in de zomer, tenzij de onderzoeker toegang tot een laboratorium kolonie heeft, maar de soorten gebruikt (Melanoplus sanguinipes) gemakkelijk cellen en lang, gemakkelijk-aan-manipuleren chromosomen afgevlakt is.

Een andere reden waarom micromanipulation experimenten zijn gedaan door een klein handvol biologen is dat micromanipulators die goed bewegen van chromosomen zelden beschikbaar in de markt zijn. We hebben ontdekt dat een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator de beweging van de naald met geen trillingen, drift, of lag tussen de joystick en de beweging van de naald bestuurt, maar andere soorten manipulatoren ook met succes chromosomen duwen kunnen rond in de cel. De micromanipulators ontworpen door Ellis en Begg^25,26 zijn ideaal voor de micromanipulation van de chromosomen, hoewel ze gebruik van oudere technologie. Piëzo-elektrische micromanipulators zijn momenteel beschikbaar en gebruikte in de elektrofysiologie; Deze micromanipulators zijn echter niet typisch joystick-gecontroleerde. Joystick-controle is de sleutel tot de vloeiende bewegingen die nodig zijn voor een succesvolle micromanipulation, en zo een aangepaste joystick te maken van de momenteel beschikbare piëzo-elektrische micromanipulators werken voor een chromosoom micromanipulation moet worden gebouwd. De joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulators die het beste werken hebben directe positie controle, waarin de beweging van de joystick rechtstreeks naar een beweging van de naald vertaalt.

Een nieuw ontworpen piëzo-elektrische micromanipulator figuur kan worden geconstrueerd van verkrijgbare onderdelen die gemakkelijk kunnen worden vervangen en van sommige kleine 3D-gedrukte onderdelen, en het werkt goed voor chromosoom micromanipulation²⁴. De micromanipulator heeft instelbare gevoeligheid, handmatige grof positionering, en geen trillingen, drift, of lag in de beweging van de naald, en de controle van de directe positie van de naald. Wetenschappers kunnen construeren de micromanipulator met behulp van instructies beschikbaar online²⁴. Hieronder vindt u de methoden voor het voorbereiden van de cultuur van de cel van een primaire spermatocyte en micromanipulating de chromosomen in de cellen in die cultuur.

Protocol

1. bereiding van de cultuur van de cel van de primaire Insect Spermatocyte Micromanipulation Prepareren van objectglaasjes Het verkrijgen van een glasplaatje 75 x 25 mm met een 20 mm diameter ronde gat in het midden van de dia uitgesneden.Opmerking: Deze werden gesneden uit een vel van vensterglas tot de grootte van een glasplaatje met een gat in het midden. Een 25 mm x 25 mm #1.5 dekglaasje aan doorlopen een vlam Bunsenbrander voor 2 s. Vacuüm vet rond de rand van het gat in …

Representative Results

Figuur 6 toont een micromanipulation monster van 2 aangrenzende sprinkhaan primaire spermatocyten in diverse voorbeelden van de mogelijke toepassingen van de micromanipulation. Dit experiment werd gedaan met behulp van een omgekeerde, fase contrast Microscoop. De 0:00 (tijden weergegeven zijn in min:s) afbeelding toont beide cellen vóór de manipulatie. Één chromosoom in de onderste cel wordt weergegeven onder spanning toegepast door de micromanipulation-n…

Discussion

Met praktijk kan chromosomen bewegen in de cel tweede natuur geworden. Naalden die zowel voldoende stijf en voldoende dun-tipped zijn moeilijk om “de handigheid van” fabriceren, maar dit vermogen komt ook met de praktijk. Naalden die zo fijn dat ze vervormen wanneer verplaatst in de halonen-olie zijn bruikbaar niet voor het duwen van de chromosomen in de cel. Naalden die zo bot dat hun tips zichtbaar zijn en zo groot als 1/3 van de breedte van een chromosoom (of groter) zeer waarschijnlijk zijn te doden van de cel. De op…

Materials

VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25×25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order–call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300