昆虫精母细胞中染色体的显微操作
Summary
在本协议中, 我们描述了用于显微操作的合适细胞的选择和制备, 以及使用压电微操作机器人在这些细胞中重新定位染色体。
Abstract
染色体显微操作是照亮染色体 congression、主轴检查点和后期染色体运动机制的重要方法, 是了解控制染色体运动的关键。在细胞分裂期间。一个熟练的生物学家可以使用微操作机器人从主轴分离染色体, 重新定位细胞内的染色体, 并使用一个小的玻璃针和一个非常细的尖端对染色体施加作用力。虽然可以使用其他方法 (如光学陷印和激光的其他用途) 对染色体进行摄动, 但迄今为止, 没有任何其他方法允许将蜂窝组件重新定位在十到成百上千微米的尺度上, 对细胞几乎没有损伤。.
为染色体显微操作选择和准备合适的细胞, 特别是描述蚱蜢和板球精母细胞主要文化的制备, 用于活体细胞成像和显微操作, 是这里描述。此外, 我们还展示了一种用于在细胞内移动染色体的针的构造, 以及使用带有玻璃针的操纵杆控制压电微操作机器人在分裂细胞内重新定位染色体。样本结果显示使用微操作机器人分离染色体从主轴在主精母细胞和重新定位该染色体在细胞内。
Introduction
显微操作揭示了染色体 congression、主轴检查点和后期染色体运动的部分机制。描述显微操作实验结果的最早出版物是罗伯特. 钱伯斯1。腔室使用带有连接玻璃针的机械微操作机器人来探测多种不同细胞类型的细胞质。不幸的是, 允许在活细胞中的染色体和许多其他细胞成分的可视化的对比方法当时是不可用的, 因此钱伯斯的实验无法显示重新定位这些蜂窝组件的效果。早期 micromanipulations 改变染色体位置使用腔室装置扫描后期细胞中的主轴安备, 表明这种操作可以改变染色体臂在后期蝗虫果蝇2的位置.本特纳和他的合作者是第一个执行精细 micromanipulations 染色体, 伸展染色体3, 分离他们从主轴和诱导方向3,4, 稳定一个malorientation 通过对5、6、7的染色体施加张力, 并测量主轴在后期8、9中产生的力。本特纳实验室的其他工作表明 , 细胞质颗粒也可以纵10 , 中心体可以通过显微操作11重新定位。显微操作不仅适用于移动染色体和其他蜂窝组件。显微操作针可以通过 demembranated 细胞中的有丝分裂主轴清晰地切割12或可用于溶解核包络13。此外, 相邻的细胞可以通过显微操作14,15进行融合。
使用微操作可以完成如此广泛的有趣实验, 乍一看, 很少有染色体生物学家做过显微操作实验。这一缺陷的一个原因是, 从脊椎动物组织派生的有丝分裂培养细胞和通常用于研究染色体运动是极其困难的 micromanipulate。这些组织培养细胞通常有皮质细胞骨架, “得到在方式” 的显微操作针, 和染色体要么无法通过针或针通过细胞研磨, 导致细胞破裂和死亡。我们, 以及其他使用显微操作的实验者, 发现了节肢动物细胞能够顺应显微操作。节肢动物精母细胞很容易在一层卤烃油中传播, 在细胞分裂过程中, 细胞膜上的皮质细胞骨架也很不稳定。因此, 节肢动物睾丸提供了一个良好的来源 meiotically 分裂细胞 (精母细胞) 和有丝分裂分裂细胞 (精原细胞) 与易于访问的染色体的显微操作。一个在操作过程中固定的蚱蜢精母细胞的序列切片表明, 针头从未穿透细胞膜;细胞膜在针周围变形 (本特纳右岸导流洞, 个人通信)。精母细胞从一些昆虫和蜘蛛分类 micromanipulated 成功, 包括蚱蜢, 祈祷螳螂, 果蝇, 鹤蝇, 蟋蟀, spittlebugs, 蛾, 黑寡妇蜘蛛, 地窖蜘蛛, 和 orb 编织蜘蛛3、7、17、18、19、20、21、22。从昆虫中培养、有丝分裂细胞可以 micromanipulated。例如, 蝗虫果蝇中的染色体在初级文化中有可以很容易地 micromanipulated2,23的染色体。我们怀疑, 来自果蝇和其他昆虫的可用培养线也将 micromanipulatable, 虽然我们没有测试这些细胞的技术。我们将展示如何为显微操作准备分裂的蝗虫和蟋蟀细胞。在一年中的任何时候, 蟋蟀都很容易从大多数宠物商店获得。蚱蜢只有在夏天才容易获得, 除非研究员可以进入实验室菌落, 但使用的物种 (Melanoplus sanguinipes) 有很容易扁平的细胞和长, 易于操作的染色体。
另一个原因, 微操作实验是由少数生物学家做的, 是并联, 移动染色体很好, 很少在市场上可用。我们发现, 操纵杆控制的压电微操作机器人控制在操纵杆运动和针头运动之间没有振动、漂移或滞后的针运动, 但其他类型的机械手也可以成功地推动染色体在牢房里由埃利斯和 Begg25,26并联设计的是染色体显微操作的理想选择, 尽管它们使用较旧的技术。压电并联目前可用, 并常用于生理学;但是, 这些并联通常不受操纵杆控制。操纵杆控制是成功的显微操作所需的平滑运动的关键, 因此, 应构建自定义操纵杆, 使当前可用的压电并联工作于染色体显微操作。操纵杆控制的压电并联的工作最好有直接位置控制, 在其中的操纵杆的移动直接转换为针运动。
新设计的压电微操作机器人可从可轻松更换的商用部件和一些小的3维印刷元件中构造, 适用于染色体显微操作24。微操作机器人具有可调节的灵敏度, 手动粗定位, 无振动, 漂移, 或滞后的针运动, 和直接位置控制的针。科学家可以使用在线24上提供的指令构造微操作机器人。以下是制备主要精母细胞细胞培养的方法和微操作细胞内的染色体。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过练习, 在细胞周围移动染色体可以成为第二天性。针是足够僵硬和足够薄的尖端是很难 “得到的诀窍” 捏造, 但这种能力也附带实践。针是如此之好, 它们在卤烃油中移动时会变形, 对推动细胞中的染色体并不有用。针是如此钝, 他们的提示是可见的, 大到1/3 的宽度的染色体 (或更大) 很可能杀死细胞。这项协议的关键步骤是创建一个足够精细的针来推动染色体, 但不像杀死细胞那样钝。
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢杰西卡霍尔的宝贵讨论。
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
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