Micromanipolazione dei cromosomi in insetto spermatociti
Summary
In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l’uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all’interno di quelle cellule.
Abstract
La micromanipolazione dei cromosomi è stato un metodo essenziale per illuminare il meccanismo per cromosoma congression, il punto di arresto mandrino e anafase cromosoma movimenti ed è stata la chiave per comprendere ciò che controlla i movimenti del cromosoma durante la divisione cellulare. Un biologo esperto può utilizzare un micromanipolatore per scollegare i cromosomi dal mandrino, per riposizionare i cromosomi all’interno della cellula e di applicare forze ai cromosomi utilizzando un ago di vetro piccolo con una punta molto fine. Mentre perturbazioni possono avvenire ai cromosomi utilizzando altri metodi quali l’intrappolamento ottico e altri usi di un laser, fin qui, nessun altro metodo consente il riposizionamento delle componenti cellulari sulla scala di decine o centinaia di micron con poco o nessun danno alla cella .
La selezione e la preparazione delle celle appropriate per la micromanipolazione dei cromosomi, in particolare descrivendo la preparazione di colture primarie di spermatocita cavalletta e Grillo per l’uso in cellule vive imaging e micromanipolazione, sono descritto qui. Inoltre, ci mostra la costruzione di un ago per essere utilizzato per spostare i cromosomi all’interno della cella e l’uso di un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick con un ago di vetro collegato ad esso per riposizionare i cromosomi all’interno della divisione delle cellule. Un risultato di esempio viene illustrato l’utilizzo di un micromanipolatore per staccare un cromosoma da un mandrino in un spermatocita primario e per riposizionare quel cromosoma all’interno della cellula.
Introduction
Micromanipolazione ha rivelato parti del meccanismo per un congression di cromosoma, il mandrino checkpoint e movimenti cromosoma anafase. La prima pubblicazione che descrive i risultati degli esperimenti di micromanipolazione era di Robert Chambers1. Chambers utilizzato un micromanipolatore meccanico con un ago di vetro allegata per sondare il citoplasma di un certo numero di diversi tipi di cellule. Purtroppo, i metodi di contrasto che ha permesso la visualizzazione dei cromosomi e molti altri componenti cellulari in cellule viventi non erano disponibili al momento, quindi esperimenti Chambers’ non potevano mostrare gli effetti di tali componenti cellulari di riposizionamento. Micromanipulations precoce che ha alterato la posizione di cromosoma utilizzato apparato Chambers a spazzare la fosforila mandrino in cellule anafase, mostrando che tali manipolazioni potrebbero alterare la posizione dei bracci cromosomici in neuroblasti di cavalletta anafase2 . Nicklas e i suoi collaboratori furono i primi a eseguire bene micromanipulations dei cromosomi, stretching i cromosomi3, staccandole dal mandrino e inducendo un riorientamento3,4, stabilizzando una malorientation applicando tensione al cromosomi5,6,7, e misurando le forze prodotte da mandrini in anafase8,9. Altri lavori di laboratorio Nicklas ha mostrato che i granelli citoplasmici potrebbero anche essere manipolato10 e che centrosomi potrebbero essere riposizionati di micromanipolazione11. Micromanipolazione non è solo utile per lo spostamento di cromosomi e altri componenti cellulari. Un ago di micromanipolazione in modo pulito può tagliare attraverso un fuso mitotico in demembranated cellule12 o può essere utilizzato per sciogliere la busta nucleare13. Inoltre, le celle adiacenti possono essere fusi da micromanipolazione14,15.
Con una vasta gamma di interessanti esperimenti che può essere fatto utilizzando micromanipolazione, è a prima vista sorprendente che micromanipolazione esperimenti sono stati condotti dai biologi del cromosoma molto pochi. Una ragione per questa carenza è che divide mitotically cellule coltivate derivate dai tessuti dei vertebrati e sono comunemente usate per studiare i movimenti del cromosoma sono estremamente difficili da micromanipulate. Queste cellule hanno generalmente un citoscheletro corticale che “si mette di mezzo” della micromanipolazione dell’ago e cromosomi o non raggiungibili con l’ago o l’ago macina attraverso la cella, portando a una rottura delle cellule e la morte. Abbiamo e altri sperimentatori che usano micromanipolazione, abbiamo trovato degli artropodi cellule per essere suscettibili di micromanipolazione. Spermatociti artropodi sono facilmente diffondersi sotto uno strato di olio halocarbone e sembrano avere un molto meno robusto citoscheletro corticale sottostante la membrana delle cellule durante la divisione cellulare. Così, testicoli dell’artropodo forniscono una buona fonte di cellule di divisione meiotically (spermatociti) e mitotically per dividere le celle (spermatogoni) con cromosomi facilmente accessibili per micromanipolazione. Una divisione di serie di un spermatocita cavalletta fissata durante una manipolazione ha rivelato che l’ago non penetri mai la membrana delle cellule; la membrana cellulare si deforma intorno all’ago (Nicklas R.B., comunicazione personale). Spermatociti da un certo numero di taxa insetto e ragno sono state micromanipulated con successo, tra cui cavallette, mantidi, mosche della frutta, gru mosche, grilli, spittlebugs, falene, ragni vedova nera, ragni di cantina e orb-tessitura ragni 3,7,17,18,19,20,21,22. Le cellule coltivate, dividendo mitotically dagli insetti possono essere micromanipulated. Ad esempio, i cromosomi in neuroblasti cavalletta in una coltura primaria hanno cromosomi che possono essere prontamente micromanipulated2,23. Abbiamo il sospetto che il disponibile coltivate linee derivate da Drosophila e altri insetti sarà anche micromanipulatable, anche se non abbiamo testato la tecnica con queste cellule. Vi mostreremo come la divisione delle cellule da cavallette e grilli possono essere preparati per una micromanipolazione. Grilli sono facili da ottenere da maggior parte dei negozi di animali in qualsiasi momento dell’anno. Cavallette sono facilmente ottenibili in estate solo a meno che il ricercatore ha accesso ad una colonia di laboratorio, ma le specie utilizzate (spretus moorei) facilmente ha appiattito le cellule e i cromosomi lunghi, facile da manipolare.
Un altro motivo perché micromanipolazione esperimenti sono stati condotti da una piccola manciata di biologi è che micromanipolatori che i cromosomi si muovono bene sono raramente disponibili sul mercato. Abbiamo trovato che un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick controlla il movimento dell’ago senza vibrazioni, drift, o il ritardo tra il movimento del joystick e il movimento dell’ago, ma altri tipi di manipolatori anche con successo possono spingere i cromosomi intorno nella cella. Micromanipolatori progettati da Ellis e Begg25,26 sono ideali per la micromanipolazione dei cromosomi, anche se usano tecnologia precedente. Micromanipolatori piezoelettrici sono attualmente disponibili e comunemente utilizzati in elettrofisiologia; Tuttavia, questi micromanipolatori non sono in genere controllata mediante joystick. Joystick di controllo è la chiave per i lisci movimenti necessari per un successo micromanipolazione, e così un joystick personalizzato deve essere costruito per rendere i micromanipolatori piezoelettrici attualmente disponibili di lavoro per micromanipolazione un cromosoma. I micromanipolatori piezoelettrici controllato joystick che funzionano meglio sono controllo di posizione diretta, in cui il movimento del joystick si traduce direttamente in un movimento dell’ago.
Un micromanipolatore piezoelettrico di nuova concezione può essere costruito da parti disponibili in commercio che possono essere facilmente sostituiti e da alcuni piccoli componenti 3D stampati, e funziona bene per cromosoma micromanipolazione24. Il micromanipolatore non ha sensibilità regolabile, posizionamento manuale grossolana e nessuna vibrazione, deriva o ritardo nel movimento dell’ago e controllo diretto della posizione dell’ago. Gli scienziati possono costruire il micromanipolatore utilizzando istruzioni disponibili online24. Di seguito sono i metodi per la preparazione di una coltura cellulare spermatocita primario e per micromanipulating i cromosomi all’interno delle cellule in quella cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la pratica, muoversi cromosomi nella cellula può diventare una seconda natura. Gli aghi che sono sufficientemente rigida e sufficientemente sottile punta sono difficili da “ottenere l’abilità di” fabbricando, ma questa abilità inoltre viene con la pratica. Gli aghi che sono così belle che deformano quando spostato nell’olio halocarbone non sarà utili per spingere i cromosomi nella cella. Gli aghi che sono così ottuso che loro suggerimenti sono visibili e come grande come 1/3 della larghezza di un cromosoma (o s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jessica Hall per la sua preziosa discussione.
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
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